一、准备工作
准备工作对开展细胞培养异常重要,工作量也较大,应给予足够的重视,准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒,培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌,无菌室或超净台的清洁与消毒,培养箱及其他仪器的检查与调试,具体内容可参阅有关文献。
二、取材
在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定),经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养器血中,这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养,实际上幼体组织(尤其是胚胎组织)比成年个体的组织容易培养,分化程度低的组织比分化高的容易培养,肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理,尽快培养,因故不能马上培养时,可将组织块切成黄豆般大的小块,置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌,同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌,为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。
三、培养
将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养,则直接将组织块接入培养器皿底部,几个小时后组织块可贴牢在底部,再加入培养基。如系细胞培养,一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数,按要求以一定的量(以每毫升细胞数表示)接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后,立即放入培养箱中,使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次,观察的内容包括细胞是否生长良好,形态是否正常,有无污染,培养基的PH是否太酸或太碱(由酚红指示剂指示),此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期(数小时到数十天不等),在潜伏期细胞一般不分裂,但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养,将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代,而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质,也可能仅有不死性(Immortality)而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。
四、冻存及复苏
为了保存细胞,特别是不易获得的突变型细胞或细胞株,要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—-196℃,将细胞收集至冻存管中加入含保护剂(一般为二甲亚砜或甘油)的培养基,以一定的冷却速度冻存,最终保存于液氮中。在极低的温度下,细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法,即从液氮中取出冻存管后,立即放入37℃水中,使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
五、注意事项
1、实验进行前,无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌,以70%ethanol擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台风扇运转10分钟后,才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株,且即使培养基相同亦不共享培养基,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。
2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。
3、小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4、工作人员应注意自身之安全,须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作,并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中,应避免引起aerosol之产生,小心毒性药品,例如DMSO及TPA等,并避免尖锐针头之伤害等。
5、定期检测下列项目:5.1CO2钢瓶之CO2压力5.2CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)。5.3.无菌操作台内之airflow压力,定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000小时/HEPA)。6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750),定期更换水槽的水
6、粉末培养基配制好后(加了血清),一般在4度尽量不要超过1个月,如在-20度存放时间可长一些,但最好也不要超过3-4个月,可能对于永生化细胞株来说要求不是太高,细胞娇弱,放置时间不宜过长。
7、开紫外线照射台的时候,就将培养基、酶、DHANKS液那到室外让它自然升温。这样40分钟后,温度也升上来了。有很多人将他放到37度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生,有的常年不清洗,里面很脏,容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水浴锅那出后,最好找个毛巾插干上面的水。
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