一、原理
植物激素(planthormone)免疫定量主要有放射免疫分析(RIA)和酶联吸附免疫分析(ELISA),由于前者操作上欠安全等原因,目前常采用后一种类型。在ELISA中,抗原抗体反应的检测依靠酶标记物来实现,常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。酶可直接标记激素分子,称为酶标植物激素,也可标记于第二抗体(识别抗激素抗体Fc片段的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白),称为酶标二抗。这两类标记物分别用于固相抗体型和固相抗原型ELISA。A.固相抗体型ELISA:将抗激素的单克隆抗体(Mab)与已吸附于固相载体上的兔抗鼠Ig抗体(RAMIG)结合,然后加入激素标准品或待测样品,使其与固相化的Mab结合, 再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记激素(酶标激素)。通过测定酶标激素的被结合量,可换算出未知样品中激素的数量。B.固相抗原型ELISA:将“激素-蛋白”复合物(该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白)包被于固相载体,加入待测激素(样品或标准品)和抗IAA多克隆抗体(Pab)反应,进行竞争反应。然后让HRP标记羊抗兔Ig抗体(HRP-GARIG)与结合在固相上的Pab反应,通过测定与固相结合的酶量,换算出未知样品中激素的含量。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料:高等植物、真菌、藻类等组织或器官。
(二)仪器设备:1. 酶联免疫检测仪;2. 高速冷冻离心机;3. 恒温箱;4. 连续进样器;5. 涡旋仪;6. 96孔微孔板;7. 离心管;8. 研钵或匀浆器;9. 试管。
(三)试剂1. 洗涤缓冲液:0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液(PBS),含0.05%Tween-0;2. RAMIG溶液,或“激素-蛋白”复合物;3. 0.1%封闭蛋白(该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白);4. 抗激素Mab,或Pab;5. 激素标准品母液,及参比系列溶液(按双倍或四倍系列稀释);6. HRP标记激素,或HRP-GARIG;7. 邻苯二胺(OPD)基质液:5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS,用前加入30%H2O212.5μl。
三、实验步骤
固相抗体型elisa。
1. 用方阵法滴定选择各反应物最适工作浓度;
2. 将100μlRAMIG溶液包被聚苯乙烯反应板微孔,4℃湿盒,12h;
3. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干;
4. 加入100μl抗激素Mab溶液,37℃70min;
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