组织单个核细胞分离液研究

组织单个核细胞分离液研究

  本品为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液。主要成分是 Ficoll 400 与泛影酸葡甲胺。适用于从各种动物组织样本中分离单个核细胞， 在医疗和医学生物学研究中广泛应用。 其他人及动物多种比重细胞分离液。

    注：因不同种属不同比重分离液的细胞离散系数及细胞带电不同，所以用户在定制分离液时应提供所需分离液的比重、动物的种属及被分离细胞的名称。

一、  分离方法说明及图例

    A．取组织匀浆单细胞悬液（细胞浓度为2×10 8 -1×10 9 个/ml，具体制备方法参照“组织单细胞悬液的制备”）2ml，小心加于2ml本分离液之液面上；

    B. 以400g（约1500转/分）离心15分钟(半径375px水平转子)。

       此时离心管中由上至下细胞分为四层。 第一层； 为胎牛血清液层。 第二层； 为环状乳白色单个核细胞层。 。 。 。

       第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞放入含4-5ml细胞洗涤液的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需单个核细胞。

注： 提取率约为80%。

二、组织单细胞悬液的制备

    注：A.本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法 本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法，酶消化法由于各实验室选取的消化酶种类各不相同，请各实验室自行选择进行试验。

    B. 全过程及所需试剂要求无菌环境 全过程及所需试剂要求无菌环境。

    剪碎法：将组织块放入平皿后，加入少量组织匀浆液及20%胎牛血清；用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入5ml组织匀浆液及20%胎牛血清；用吸管吸取组织匀浆，用100目不锈钢滤网过滤到试管内；离心沉淀1500转/分×3 min，再用细胞洗涤液清洗3次，每次以500rpm短时低速离心除去细胞碎片，以200目不锈钢滤网过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×10 7 个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为2×108-1×10 9 个/ml的单细胞悬液备用。

    匀浆器法：用眼科剪将组织剪成小块；放入70ml组织研磨器内，加入2ml组织匀浆液及20%胎牛血清；缓慢转动研棒，研磨至匀浆；用5ml组织匀浆液及20%胎牛血清冲洗研器；收集细胞悬液，经200目不锈钢滤网过滤；离心沉淀800rpm×2min ，再用细胞洗涤液洗3次，离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×10 7 个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为2×10 8 -1×10 9 个/ml的单细胞悬液备用。

细胞计数方法:

    细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板（血球计数板）进行。既可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。

     不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。

     计数与计算过程

     1）、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。

     2）、用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。

     3）、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。

     4）、按下式计数细胞悬液的密度： 细胞密度＝（4个大格细胞总数/4）×10 4 个/ml×稀释倍数公式中乘以10 4 因为计数板中每一个大格的体积为：

      1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm 3 而 1ml＝1000mm 3

细胞计数要点：

     A． 进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于10 4 个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团>10％，说明细胞分散不充分; 或细胞数<200个/10mm 2 或>500个/10 mm 2 时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。

     B． 要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

     C． 取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；

     D． 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。

     E． 操作时，注意盖玻片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

三、  注意事项

     A． 本分离液是敏光型的，在运输和贮藏过程中应在18℃-25℃避光保存，启封后置4℃保存避免微生物污染。另外，本品为真空包装，未启封前置于10℃ 以下易出现白色结晶，影响分离效果。

     B． 待分离的样本要求新鲜，避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在20℃水浴箱中复温20 分钟保证分离液和所分离样本温度在20℃±2℃时分离效果最好，且所有操作过程一定要在无菌条件下进行。

     C． 由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以调节离心转数，调节离心的时间，摸索的分离条件（具体分离条件各实验室自定）。

     D． 最好使用无静电反应的离心管，推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。

     E． 最优抗凝剂选择：EDTA、枸橼酸、肝素。应注意在血液稀释过程中应去除抗凝剂体积 。

四、产品性能指标

pH 7.0-7.5

渗透压 280-340mOsmol/kg

内毒素 ≤0.5EU/ml

无菌 直接接种培养14 天后培养基澄清

澄明度及不溶性颗粒物 每50ml 溶液中含10μm 以上的不溶性微粒20 粒以下，

含25μm 以上的不溶性微粒5 粒以下

五、贮藏及保存期限

    18℃-25℃避光保存，有效期两年。启封后置4℃保存，有效期一周。

    注：若保证无微生物污染，启封后可置4℃长期保存。但应注意保存温度较低时本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

细胞培养试剂人或各种动物组织单个核细胞分离液订购说明：

1、绝大部分产品备有现货，一般情况下都能订货当日发货。

2、部分非常用产品，需提前1－2日预订，海外期货则需要提前3-6周预订。

3、部分产品价格会因货期、批次等因素发生变化，若有变动以订货当日最新价格为准。

4、每日订单截止时间为16点整，部分城市可到17点整，因超过截止时间造成当日不能发货的将于次日安排发货。

5、请办理完货款后，将收据、底单等连同收货人的地址、姓名、电话等以传真、EMail、短信、电话等形式通知我们。

细胞培养试剂人或各种动物组织单个核细胞分离液运输说明：

1、极低温产品：极低温产品运输过程中加装干冰运输。用干冰把产品包裹起来，再用泡沫盒密封，胶带层层粘住泡沫盒，放入索莱宝专用的箱子，然后交付给合作快递，安全快速高效放心的送至客户的手中，保证产品的性质稳定如一，为您的实验保驾护航。

2、低温产品：低温产品运输过程中加装索莱宝专用冰袋运输。事先用冰袋把产品包裹起来，再使用泡沫盒密封，用胶带严实密封泡沫盒，再放入索莱宝专用的箱子（保温效果最少可以持续一周），然后交付给合作快递，安全快速高效放心的送至客户的手中，保证产品的性质稳定如一，为您的实验保驾护航。

3、常温产品：常温产品运输过程中无需加冰或者特殊包装。产品由公司库房人员快速配货，准确快速高效的快递保证产品快速送达您的手中。