二硝基水杨酸法萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定

萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定

一、研究背景及目的

酶是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成（少数为RNA）。能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。

细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。因此，对酶的研究是十分重要的。通过对酶活性的测定，可以更好地了解生物体的代谢过程。其中，淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，可以分成α-淀粉酶，β-淀粉酶等。α-淀粉酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的α-1，4-链。β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1，4-葡聚糖链。

根据其催化产物的特点和现有测定方法规定酶活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化产生的麦芽糖毫克数。

 3,5－二硝基水杨酸法是一种对还原糖定量测定的方法。还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量。麦芽糖是还原

性糖，可用该方法对其含量进行测定。

本次实验的目的在于通过实验过程，理解淀粉酶测定的原理，熟悉实验操作，掌握实验方法。

 蛋白质是生物体中广泛存在的一类生物大分子，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质，对生物来说十分重要。目前有四种蛋白质含量测定方法：凯氏定氮、Folin-酚法、染料结合法、紫外法，最常用的是后三种。

本次实验选择通过Folin-酚法测定蛋白质含量。这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。

二、实验原理

 该实验的总体思路为精确控制酶促反应的条件，保持其处于最适条件，测定酶促反应的初速度来表示酶的活力。以及通过化学反应使得蛋白质具有特异光吸收，再通过比色法测定蛋白质含量。

 该实验的理论基础为：

（1）酶的性质：淀粉酶是蛋白质，在一定的条件下会发生钝化，可利用此性质将体系中的非目标酶类钝化，从而测出目标酶类的活力；

（2）3,5－二硝基水杨酸法：3,5－二硝基水杨酸法是一种对还原糖定量测定的方法。还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，

棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。

因此，我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量。麦芽糖是还原性糖，可用该方法对其含量进行测定。

 具体反映为：

 在加热、碱性条件下：3,5－二硝基水杨酸（黄色）+还原糖—→3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红

色）+糖酸； （3）比色法原理：朗伯—比尔定律（当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,与其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比）。

三、仪器试剂

1、仪器设备：得利特北京科技有限公司DK-S24型40℃水浴锅；22列八孔型70℃电热恒温水浴锅；上TDL-408型低速离心机；得利特北京科技有限公司722型光栅分光光度计；DCL-2000 DY型电磁炉 。

2、主要实验器皿：50ml容量瓶，100ml容量瓶，研钵一套，具塞刻度试管若干，试管若干，

烧杯。

3、试剂：

 （1）麦芽糖标准液（1mg/ml）；（2）pH5.6的柠檬缓冲液： A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L） B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml

混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液；3）3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入）；

（4）麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中，

用蒸馏水定容到100ml）；（5）0.4M NaOH； 

（6）试剂甲（A）10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O·4H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。

（B） 0.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。

（7）试剂乙在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4·2H2O）,25克钼酸（Na2MoO4·

2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时标准NaOH

滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。

（8）牛血清蛋白标准溶液（250μg/ml）。

4

、实验材料：

萌发的小麦种子。

四、实验步骤

（1）酶液的制备（蒸馏水浸提）：

 称取2克萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置于研钵中加少量石英砂，蒸馏水作为匀浆液，研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中至40ml左右，浸提15-20分钟，用蒸馏水定容到刻度，混匀后3500转/心20分钟，取出上清液备用（初始酶液）。

（2）α－淀粉酶活性的测定：

A.取试管4支，注明两支为对照管，两支为测定管。

B.于每个管中各加入酶提取液1毫升，在70℃恒温水浴中（水浴温度的变化不应超过±0.5℃）准确加热15分钟，取出后迅速在水浴中彻底冷却。

 C.在试管中各加入1ml  pH5.6柠檬酸缓冲液。

D.将测定管和对照管置于40℃（±0.5℃）恒温水浴中准确保温15分钟后，向两支对照管中各加入4ml 0.4MNaOH再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5分钟后，向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4NaOH，然后准备下步糖的测定。

（3）α-淀粉酶及β-淀粉酶总活性的测定：取酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。混均后，取4支试管，2支为对照管，2支为测定管，各加入稀释后酶液及pH5.6柠檬酸缓冲液1ml，以下步骤重复α－淀粉酶测定的第D的操作。（4）麦芽糖的测定：

a.标准曲线的制作

 取15ml具塞刻度试管7支，编号，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、.0毫升，然后将各管用蒸馏水准确补充到1.0毫升，摇匀后再加入3,5-二硝基水

杨酸1毫升，摇匀，在沸水浴中准确保温5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释到15毫升，混均匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，以消光值为纵坐标以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。

b.样品的测定

取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各1毫升，分别放入15毫升具塞刻度管中，在加入1毫升，3,5-二硝基水杨酸试剂混匀，置于沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，蒸馏水稀释至15毫升，混匀，用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，根据标准曲线，进行结果计算5）水溶性蛋白的测定

A.标准曲线的测定：

 取6支大试管分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）

。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，迅速混匀，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。然后在室温放

置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm处测定各管中溶液的

吸光度值。以蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。

B.样品的测定

 取酶液2ml，加入6ml蒸馏水，作为待测液。按上述方法进行操作，同时进行。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

（6）结果计算

 α-淀粉酶活性（毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1）= = 

毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1 （α-+β-）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1）= = 毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1 A—α-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度A’—α-淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度B—α-及β-淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度B’— α-及β-淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度.