在此次的新型冠状病毒疫情中,核酸检测作为确诊的金标准发挥着重要的作用。众所周知,本次新冠病毒的核酸检测流程为采样(咽拭子、肺泡灌洗液),提取病毒RNA,再经过RT-qPCR或者一步法RT-数字PCR检测样本。但近期关于核酸检测准确性的讨论也甚嚣尘上,其中PCR实验污染是导致实验有偏差的原因之一, 造成PCR实验污染的主要原因有以下几点,样本间交叉污染(样本泄漏引起的交叉,样本提取过程中移液器、耗材的污染),PCR试剂的污染(容器、耗材、移液器,水等被污染),PCR扩增产物污染,气溶胶污染,克隆质粒污染等。
在病毒核酸检测过程中,结果的准确性除了检测方式的灵敏度很重要以外,保证提取RNA样本的完整性也十分重要。今天我们就聊聊如何防止RNA降解,获得高质量的RNA进行后续试验。导致RNA降解最主要的物质就是RNase,RNase非常稳定,且无处不在,用常规的高温高压蒸汽方法和蛋白酶抑制剂不能使所有的RNase完全失活。
RNase结构
除上述方法外,研究人员最常用的就是使用DEPC等对实验过程中使用的耗材和试剂进行处理,但DEPC处理时间长且有毒,下面给出远离DEPC的三大理由:
1、DEPC 对人体有害,DEPC为高活性烷化试剂,能对蛋白质进行共价稀释,使其组氨基团的乙氧基甲酸化(RNase 活性位点有两个组氨基酸,故能被灭活);同时能使 RNA 分子中没配对的腺嘌呤羟甲基化,改变其活性,严重时会影响 RNA 形成杂交双链的能力,归为强致癌物,使用时要十分小心。
2、不能处理一些试剂:例如:一级胺的试剂TRIS,PBS等,会发生化学反应;二是不能高压灭菌的试剂,DTT,dNTP,Mgcl2,因为 DEPC必须通过高压灭菌去除;三是不能用于PH低于4及以下的试剂,DEPC在此条件下对RNase没有灭活作用。
3、DEPC不适合某些实验,测OD值的实验,OD读数跟 PH 有关, DEPC 在溶液中分解后变成乙醇和二氧化碳,部分二氧化碳与水反应形成碳酸,导致 PH 降低,进而降低OD值。
实验者迫切需要一种非常快速且方便的去除RNase的方法,保证结果的准确性。使用 KeyPro™KP100生物污染紫外净化仪,通过275nm和365nm双紫外的协同作用可在5min解除上述污染烦恼。免清洗,无化学残留,方便快捷,适用于高保真 RNA 文库制备,测序和 PCR 实验室中的微孔板去污、移液器、水、金属、陶瓷、塑料、玻璃等表面RNase的灭活等。同时KeyPro™KP100还可以去除病毒和细菌等的污染,防止实验用品导致的实验结果和环境污染。
KeyPro™KP100 生物污染紫外净化仪采用 SLM™专利技术将 LED 阵列,光学元件和热冷却技术集于一身,可最大限度地提高消毒和去污性能,为您节省宝贵的科研时间。
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