定量western blot 一定要有内参质控(上)
Western Blot是生物修炼的一大实验,现在不做定量Western Blot,都不敢自诩学霸的了,暗暗擦汗的有没有?
在讨论如何从Western Blot中获得定量数据之前,先定义一下我们所说的“定量”是什么意思是非常有用的,何为定量,必须符合下列准则:
. 使用一个定义的过程进行检测,即Western Blot。
. 这个过程产生一个可重复的结果,即是精确度。
. 测量反映了一个“真实”的结果,即是准确度。
定量Western Blot除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,是一定要检测内参的,也就是内部参照(Internal Control),目的是校正蛋白质转印和上样过程中导致的实验误差,保证实验结果的准确性。对于哺乳动物细胞表达来说,内参通常指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用其作为参照物。
在发表文章时,Western Blot实验结果需内参进行校正,但仍有一些科研人员在实验中忽略内参的使用,将蛋白浓度测定作为规范是比较各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法,都存在局限性,例如BCA方法对还原性试剂兼容性差,Bradford方法对去垢剂兼容性差,A280方法影响因素比较多,不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。在Western Blot实验时使用内参,即可简便地对转印和上样步骤产生的误差进行校正。
谁能看出这是“GAPDH”
那么如何实现Western Blot实验中内参的检测呢?简单讲就是在WB过程中,除加入靶标蛋白的抗体外,也加入内参蛋白的抗体,同时实现靶标蛋白和内参蛋白的检测。通过归一化,可以校正上样误差和转印误差,从而获得比较准确的Western Blot结果。
使用荧光方法进行定量Western Blot检测,可进行多重检测,荧光信号稳定,持久,影响因素少,不用剥离膜和剪膜,实验条件一致,更容易获得定量Western Blot的数据。Azure600可以同时进行4通道荧光成像,无需剥离和重孵育,靶标蛋白和内参蛋白同时在一张印迹膜上成像,更容易被期刊杂志接收。
如果蛋白表达是高丰度的,可见荧光方法也可以尝试,如果是3色RGB可见荧光,能够同时检测两种靶标蛋白和一个内参蛋白。
小编列出了常见蛋白质内参,供参考哈:
想了解更多关于内参选择的小伙伴敬请期待下期精彩内容。
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