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既然仪器已经备好了,那么该怎样选择检测方法呢?
众所周知,qPCR依托于荧光检测技术,通过使用DNA结合染料、荧光PCR引物或探针等实时监测目的基因的扩增,从而对目的基因进行定量分析。为了避免在实验时出差错,下面就跟着小编一起来看一下常用的经典方法吧~
1、 DNA结合染料—SYBR Green I 法
• 原理:SYBR Green I 是一种DNA结合染料,其与双链DNA结合后,荧光大大增强,DNA与染料结合所释放的荧光量与dsDNA的数量成正比。因此,检测到的荧光信号可反映出PCR体系存在的双链DNA数量。
• 特征:可逆荧光,最大吸收波长497nm,最大发射波长520nm。
• 适用情况:非特异性的荧光染料,不能识别特定的双链,只要是双链(包括非特异性扩增产物、引物二聚体等)就会结合发光,在临床上使用可能会有假阳性发生。但该方法容易建立实验体系,可进行熔点分析,通用性好,价格相对较低,在科研中使用比较普遍。
2 、TaqMan 探针法
• 原理:检测时除了需要一对特异性引物外,还需要一条与靶序列互补配对的寡核苷酸链—TaqMan探针,其5’末端包含荧光报告基团R,3’末端为淬灭基团Q。当探针与靶序列互补配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而淬灭。在进行延伸反应时,聚合酶的5’核酸外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。荧光信号和产物的量相匹配。
• 特征:检测到的是积累荧光,随着循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。
• 适用情况:特异性较强,可进行多重qPCR分析,但成本较染料法要高一些,实验构建相对复杂。常用的荧光基团推荐:FAM、VIC、HEX、CY5等。
3 、分子信标(molecular beacon)
• 原理:分子信标方法在检测时除了需要一对引物以外,还需要一条呈发夹结构的寡核苷酸探针(25-40nt),分子信标的 5'端附有荧光报告基团,3'端附有淬灭基团,环被设计成与靶序列互补的15–30核苷酸,其两端各有5-7个核苷酸互补形成茎结构,将报告基团与淬灭基团连接到一起。发夹结构中,由于报告基团接近淬灭基团,监测不到荧光信号,当环的部分与核酸序列互补配对,分子信标打开成链状,使得荧光基团与淬灭剂分开,发射荧光。
• 特征:茎环结构,也是积累荧光。
• 适用情况:高特异性、可以用于多重反应,适合区分等位基因。但不能做熔点分析;发夹的茎结合过强过弱都不合适,过强的话,信标不能与靶标正确杂交,过弱的话,会随机折叠成非发夹结构,导致产生杂信号。常用的荧光基团有FAM 、Texas Red等。
4 、荧光共振能量传递(FRET)
• 原理:FRET探针又称双杂交探针,由两条相邻探针组成。第一个探针3'端带有供体基团,第二个探针的5'端带有受体基团,在PCR反应的退火步骤,两条探针头尾相连地分别杂交在靶标序列上,荧光分子接近,从供体到受体产生荧光共振能量传递,受体荧光信号的增加与扩增子出现的量成比例。
• 特征:由于FRET探针是靠近发光,所以检测信号是实时信号,而非积累荧光。
• 适用情况:除引物外需要设计两条探针,通用性不高;需挑选合适的供体及受体基团,供体基团发射波长与受体基团的激发波长需显著重叠,而供体基团发射波长与受体基团的发射波长要明显分离。可做熔点分析,特异性较强。
5 、 LUX Primers
• 原理:LUX (light upon extention) 引物是通过荧光标记的引物,使引物可以实现探针的功能。其原理和分子信标类似,LUX引物也是发夹结构,其中一条引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下,该引物自身配对,形成发夹结构,使荧光淬灭。在模板存在的情况下,引物与模板配对,发夹结构打开,产生荧光信号。
• 特征:积累荧光;不需要额外设计探针。
• 适用情况:不能进行熔点分析,通用性比不上SYBR Green I。但不需要专门设计探针,同时不会受非特异性扩增产物和引物二聚体的影响,特异性较SYBR Green I强。
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