做Western Blot的小伙伴,你是不是还在那里熬夜赶实验?是不是还在纠结今天的结果怎么和昨天的差异这么大?是不是在为选择哪种检测方法而烦恼?在为实验的重复性而抓狂?今天小编就和大家聊一下Western Blot中遇到的问题以及应对方法。
归一化问题:
做Western Blot经常需要对蛋白进行归一化,经典的归一化方法是看家蛋白归一化,看家蛋白需要选择在不同样品间稳定表达的蛋白;其次表达丰度也需要筛选,如果丰度过高,目的蛋白丰度与看家蛋白差异过大,那两者检测定量时就不在一个线性范围。这样的筛选过程非常耗时耗力。即使筛选到合适的看家蛋白,对其归一化的过程也需要多次重复调节才可以。
检测灵敏度问题:
小编做Western Blot检测时,由于目的蛋白含量低经常曝光不出来,同时老仪器检测灵敏度不够高,只能不断调整实验,提高上样量,再反复进行摸索,做Western 做到怀疑人生。
蛋白定量重复性问题:
Western Blot检测时,化学发光依赖酶活性和底物浓度,发光信号不稳定,因此定量时容易出现误差,重复性相对较差,也只能不断实验来进行调整和验证。
多个目的蛋白检测问题:
Western Blot检测时,有时需要对多个蛋白进行检测,这时的实验就会变的繁琐,需要对每一个蛋白进行表达检测,剪膜,剥离膜经常要做,但是经过这些步骤又会影响定量的精准性,小编也很为难。
那么上述问题有没有好的解决方法呢?这里悄悄告诉大家一个好消息,采用Sapphire双模式多光谱成像系统,可以很好的解决上述困扰,好文章也在向你招手。
Sapphire成像系统采用双模式,既有扫描式又有CCD成像式;多达四激光激发用于荧光成像,每个通道配有自己独立的检测器,PMT检测器用于蓝光成像,3个APD检测分别用于绿光、红光和近红外检测,高分辨率CCD用于化学发光检测,在全光谱范围内避免信号损失;动态范围可达6log;软件操作简单,易于上手。
应对均一化问题,已有众多期刊建议采用总蛋白均一化,总蛋白均一化能够更加真实的反应目的蛋白表达量的变化,同时也无需繁琐的筛选看家蛋白、调整蛋白上样,只需对总蛋白进行染色和调整,Azure提供总蛋白归一化试剂和相应的AzureSpot分析软件,轻松搞定蛋白均一化问题 。
应对低丰度蛋白检测问题,Sapphire双模式多光谱成像系统可以加配610万像素,大光圈的优质CCD检测器,其检测灵敏度可以达到fg级,动态范围是传统胶片的4倍。可以进行累积曝光,可以快速得到你需要的图像,无需多次重复和改变上样。
应对重复性问题,荧光检测方法与传统的化学发光不同,荧光检测方法不依赖酶活性和底物,二抗标记荧光基团,信号强度和上样量成线性关系,信号持久,可以得到更好的重复性结果,实验可以快速完成。
应对多种蛋白检测问题,荧光检测的一个好处是,无需剥离和重孵育,即可在一张印迹膜上进行多种蛋白的检测,减少蛋白变化的误差,实现精准定量。
Azure Sapphire双模式成像系统
无需再为Western实验所累
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