实时荧光定量PCR技术是通过测定RNA的转录水平来评估基因的活力。RNA样本提取的质量直接影响基因表达分析。影响RNA品质的因素有以下三种:RNA浓度、RNA纯度和RNA完整性。
检测RNA浓度、纯度和完整性的方式主要有以下几种:
紫外分光光度计法:
测量260nm吸收值计算RNA浓度,测量260nm/280nm吸收值的比值,用于评估RNA纯度。需要注意的是:在检测核酸物质时应该在固定的PH溶液中进行。
260nm/280nm的比值范围在 1.9~2.1 之间。<1.9,说明有蛋白质残留;>2.1,说明RNA可能发生降解。
琼脂糖凝胶电泳:
完整的RNA通常有三条带,最亮的是28S条带,其次是18S条带,最淡的是5S条带(部分试剂盒提取时会过滤掉5S条带)。通过琼脂糖凝胶电泳可以检测28S和18S的比值。该方法主要用于检测RNA的纯度和完整性。
如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利,28S的亮度在18S条带的两倍以上,我们认为RNA的质量最好。
若RNA条带出现弥散,原因可能:RNA被核酸酶降解、电压或电流过大、上样量过高或过低等。
上述两种方法在实验室比较常用,此外还有几种检测方式供大家选择。
荧光染料检测:
通过荧光染料和RNA结合,荧光活性增强。此方法的灵敏度较高,主要用于检测RNA的浓度。
微毛细管电泳:
可使用软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估,10为RNA完整性最好,0为最差。此方法的灵敏度和分辨率较高,可用于检测RNA浓度、纯度和完整性。
3’-5’完整性检测:
是在一个RNA样本中检测GAPDH mRNA的完整性来代表所有RNA的完整性,主要用于检测RNA的完整性。
得到高品质RNA的小建议:
1、尽量避免RNA酶污染,使用无RNA酶的耗材和试剂,建议将扩增前后的场所分开。
2、尽量减少采样时间,样品处理后快速冷冻,可以加入RNA保护剂。
3、RNA提取过程中可以使用RNA酶抑制剂。
4、存储过程中避免反复冻融。
Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统
Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统来自于美国Azure Biosystems公司,可为您提供3/6检测通道,根据实验需求灵活配置。这款产品采用了高能LED作为光源系统,可保证光源强度高,光源一致性好;高品质的帕尔贴温度模块作为温控系统,升降温速率快,可设置12列跨度30°C的温度梯度;卓越的CMOS拍照+光纤信号传输作为检测系统,CMOS检测灵敏度高,光纤传输速度快,无光损失和噪音干扰,无需ROX校准。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统可为您的科学研究提供高精准度、高灵敏度和高可靠性的实验结果。
浅谈CGT赛道PCR技术的应用优势
精卫自动PCR扩增仪震撼来袭,带给你非凡体验
分子检测技术-点亮教学中生命科学之路
Nio™全自动数字PCR一体机系统添新成员Nio™E和Nio™,为您提供完美契合实验需求的理想机型
相关产品
CELLINK Quantum X BIO 3D生物打印系统
CELLINK BIO CELLX 3D生物打印机
CELLINK LUMEN X+™ DLP 3D生物打印系统
CELLINK BIO X™ 3D生物打印系统
Echo Revolution正倒置一体激光共聚焦显微镜
ECHO Revolution正倒置一体智能生物显微镜
ECHO Revolution正倒置一体电动化智能显微成像系统
Naica 6通道微滴数字PCR系统
Naica高通量微滴芯片式数字PCR系统
显微镜Echo Revolve 正倒置一体显微镜
荧光显微镜Echo Revolve 正倒置一体
Naica™ Crystal微滴芯片数字PCR仪
Echo Revolve相衬显微镜
Echo Revolve明场显微镜
Echo Revolve荧光显微镜
关注
拨打电话
留言咨询