PCR进阶—GC-Rich片段的扩增策略

艾普拜生物科技（苏州）有限公司

前言

PCR扩增不出来条带的原因有很多，诸如引物设计有误，DNA模板已降解，酶失活或者有杂酶污染，缓冲液条件不当，模板DNA的GC含量太高等等。大部分原因可以通过换试剂得到解决，但是对于高GC含量的样本，扩增起来始终是有难度。

模板GC含量高就难以扩增的原因在于G、C之间形成三对氢键，解链所需能量较高，故模板较难打开，在常规变性温度下，DNA模板变性不完全，同时由于单链的G＋C丰富区易于自身互补配对形成稳定的发夹环二级结构，而使PCR引物难以结合到模板上。

目前，研究学者建立了各种不同的方法来解决高GC含量DNA模板扩增困难的问题。常用的方法包括：

1、添加增强剂，如甘油、DMSO等，有助于打开复杂二级结构；

2、提高变性温度，比如96度5分钟然后再加热启动酶；

3、降落PCR，在PCR循环过程中逐步降低退火温度，从而在初始阶段提高退火温度, 减少非特异性结合，提高特异性扩增；

4、提高PCR扩增仪的瞬时功率，利用更大的能量打开DNA的二级结构，从而提高PCR反应的效率‌。

PCR技术不断发展, 高功率PCR扩增仪已作为一项新型技术，逐渐被应用于解决GC含量高的DNA模板扩增难题。这种仪器通过提供更强的热循环能力，能够有效地打开DNA的二级结构，特别适合于高GC含量的样本扩增。

艾普拜生物重磅推出精卫自动PCR仪, 瞬时功率可达750W, 不仅提高了复杂样本扩增实验的成功率，还大大缩短了实验时间，为研究人员提供了强而有力的科研工具。

精卫自动PCR仪的优势：

1、更高效的热循环: 高功率可以减少达到变性温度所需的时间，使模板能够充分变性，为后续的引物结合和延伸步骤创造良好条件。

2、均匀的热传递: 高功率 PCR 仪能够提供更均匀的加热，避免部分模板无法完全变性或引物结合不充分导致扩增不成功，提高反应的稳定性和重复性。

3、适应高难度的PCR反应: 在一些特殊的 PCR 应用中，如长片段DNA 、高 GC 含量的样本扩增、复杂二级结构等。

4、减少温度波动: 对于高 GC 含量的模板，温度的微小波动可能会影响 DNA 双链的稳定性和引物的结合效率，高功率 PCR 仪可以更好地维持温度的稳定性，保证高 GC 片段的顺利扩增。

应用案例：

仪器：Kingwell 96，高GC含量，反应体系：10ul

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