早前,江必旺博士分享了《浅谈令人“爱恨交加”的Protein A亲和层析介质》、《盘点Protein A亲和填料质控必看的重要参数》,本期带大家了解Protein A 亲和层析介质的制备过程中需要考虑的那些影响因素以及纳微科技带来的创新成果,也欢迎大家在评论区留言讨论。
纯化后的Protein A配基可以通过其分子上的氨基或末端的巯基与微球上的功能基团偶联制备成Protein A 层析介质。Protein A层析介质的性能与其本身的配基性能,基球材料组成,基球孔径大小,孔容积及表面功能化等都有关系。为了高效率把目标生物分子从复杂样品里分离出来,并保持其生物活性,用于分离纯化的层析介质材料必须满足苛刻的要求如介质材料组成、形貌、粒径大小、粒径分布、孔径大小和分布、功能基团、及表面亲水性能等。
Protein A材质的影响
目前Protein A 亲和层析介质基球主要由两大类材料组成:第一类是以琼脂糖,葡聚糖为代表的多糖层析介质;第二类是以聚丙烯酸酯和聚丙烯酰胺为代表的合成高分子层析介质。其中天然多糖高分子改性介质由于具有亲水强,生物兼容性好,能减少对生物分子的非特异性吸附等特点,因此在分离过程中容易保持生物分子的生物活性。另外交联天然多糖介质在溶胀状态下其多糖分子链可以舒展开来形成网状孔道结构,因此多糖介质表面积大,容易做成高载量的介质。软胶是生物大分子分离纯化应用历史最悠久,最广泛的亲和层析介质。但天然多糖改性高分子介质因其基质柔软而被称为软胶,其主要缺陷是机械强度差、压缩比大、柱床不稳定、操作困难、流速慢、生产效率低等,另外软胶在干燥状态下脱水容易导致孔道结构塌陷从而失去分离性能,因此,软胶填充的层析柱床一般不能脱水。相反,合成多孔高分子层析介质微球具有机械强度高,化学稳定性好等特点,因此可以耐受更大的压力、更快的流速,从而提高分离效率,虽然其在市场应用的晚但其市场增速最快。另外合成高分子微球粒径大小,粒径均匀性更容易控制,使得合成高分子介质更容易装柱,柱效和分辨率也更高。同时聚合物介质孔道结构是通过无数高度交联的纳米粒子堆积而成。这些纳米粒子不溶胀,分子进不去,因此其表面积比琼脂糖基质的小,但孔径通透性更好,因此分子传质速度快,在高流速下载量可以保持的更好。但合成高分子层析介质的缺点是其疏水往往比软胶大,导致非特异性吸附大,容易使生物分子失去活性。因此聚合物微球表面需要进行亲水化改性以降低其非特异性吸附才能满足层析分离的需求。无论是以交联琼脂糖为基质的离子交换介质还是以表面亲水化改性的聚合物为基质的离子交换介质都有各自的优缺点,但它们的目标都是一致的,都是往高载量、高机械强度,高分辨率、高回收率方向发展。因此为了生产更理想的层析介质,交联琼脂糖层析介质要解决的问题是在保持它亲水性优势下如何提高其机械强度,而聚合物介质问题是在保持其机械强度优势条件下如何解决亲水化问题并降低非特异性吸附。
介质孔径大小及孔隙率对生物分离的影响
除了粒径大小和分布会影响层析介质分离性能外,孔径大小、比表面积及孔隙率也是生物分离纯化介质最重要参数之一。层析分离模式主要是分子与介质表面功能基团作用的结果,层析介质可及比表面积是影响其吸附载量的主要因素之一,可及比表面积是分子可到达的内孔表面积加上介质外表面积。由于内孔表面积占据整个比表面积的90%以上,而内孔表面积主要由孔径大小,孔隙率来决定。孔径越小比表面积越大,但如果孔径太小,目标生物分子进不去,这样的小孔及其表面积对分离是没有作用的。孔径太大,比表面积也会降低,因此对于不同分子量大小的生物分子,有个最优的孔径大小,其可及表面积最大,分离效果最好。比如说用于抗生素这类分子量小的生物分子,孔径一般选择小于30纳米以下,而对于抗体蛋白分离纯化的介质一般选择孔径在100纳米左右,而对于病毒这种大尺寸的生物,需要400纳米以上超大孔的介质。
另外孔隙率越大,比表面积越大,载量也会越大,同时机械强度越差,因此选择孔隙率也需要平衡机械强度和载量的要求
Protein A 配基的影响
Protein A 亲和层析分离是基于Protein A 配基与抗体的特异性结合。天然Protein A 来源于金黄色葡萄球菌的一个株系,它含有5个可以和抗体IgG 分子Fc 段特异性结合的结构域。由于天然的Protein A 配基耐碱性差,为了提高Protein A 耐碱性,延长其使用寿命,因此现在市场上使用的Protein A都是经过天然Protein A序列改造过的重组蛋白。每家重组蛋白A的序列不同,亲和力不同,洗脱pH 条件不同,耐碱性能不同。Protein A 配基对抗体纯度,回收率等有重要影响。
粒径大小和粒径均匀性的影响
粒径大小和均匀性不仅影响柱效,分离效率,对Protein A 载量影响也很大。粒径越小,分子传递路径越短,Protein A 与抗体结合的效率越高,载量就越大,比如说以琼脂糖为基质的Protein A 介质,如果粒径是90微米,载量只有50毫克/毫升,如果粒径减小到50微米,载量可高达90毫克/毫升,因此粒径与载量成反比,但粒径越小,反压越大,因此选择粒径大小需要考虑压力和载量。另外粒径越均一,其洗脱越集中。
粒径分布均匀,形貌规整的球形填料填充柱床的紧密程度一致性好,流动相在柱床中的流速均匀,流动相经过柱床的路径长短一致,从而有效降低涡流扩散系数,使色谱峰宽变窄,理论塔板数升高。
纳微十多年坚持不懈的研究开发出世界领先的微球精准制造技术,该技术可以对微球的材料组成、粒径大小、粒径均匀性、孔径大小及表面性能达到前所未有的精准控制。纳微利用这一技术平台开发出新一代单分散多孔聚丙烯酸酯为基质的Protein A 亲和层析介质克服了传统Protein A 软胶的缺点。
纳微Protein A 介质创新点主要有以下几点:
首先,纳微Protein A 介质具有精准的粒径大小和高度的粒径均一性,使其具有流速均匀、洗脱集中、流动相用量少而且装柱容易、柱效高、柱床稳定、压力低、柱与柱重复性好等优点;
图4 纳微单分散Protein A介质与传统软胶基质微观结构对比
图5 传统多分散Protein A亲和软胶与UniMab液流路径对比示意图
第二,纳微Protein A 基球经过优化筛选专门设计的大孔结构,其孔径远大于GE Protein A 产品。因此该介质具有蛋白传质速度快,使得介质在高流速下具有高载量。从实验测试数据可以看到,纳微UniMab与GE MabSelectSuRe在驻留时间大于4分钟时,载量都差不多,当驻留时间小于2分钟时UniMab的载量高于MabSelectSuRe载量50%以上, 而且速度越快UniMab载量优势越明显。抗体生产效率是由载量和流速共同决定,但流速越快载量越低,因此对于每个亲和层析来说有个最优的流速。实验证明对于批次亲和层析,驻留时间是2分钟时生产效率达到最高,对于连续层析驻留时间是1分钟时生产效率最高;
图6 UniMab与MabSelectSuRe产品不同驻留时间动态载量对比
图7 不同Protein A 层析介质驻留时间与抗体生产效率与关系对比
从抗体流穿曲线对比图也可以看出具有大孔结构及高度粒径均匀性的单分散Protein A亲和层析介质与进口软胶相比具有更陡的穿透曲线,说明纳微单分散层析介质具有更畅通的孔道结构,分子在介质里扩散速度快。抗体流穿少,回收率高。
图8 抗体流穿曲线对比图
第三,纳微Protein A 基球是高度交联的聚丙烯酸酯组成,与市场上软胶或低交联度聚丙烯酸酯为基质的Protein A 介质相比具有溶胀系数小,压缩比例低,而且具有优异机械性能,可以承受更高流速条件产生的压力,并装更高的柱床,有利于增加抗体批处理量,提高抗体生产效率,减少设备投资。UniMab在2公斤压缩比例只有5%,而市场上Protein A 介质压缩比例往往超过15%。
图9 UniMab与软胶与压力流速曲线对比
第四,纳微用于Protein A 介质的基球是通过多步表面亲水化改性,因此表面亲水性能好,非特异性吸附低,在抗体分离过程中,HCP去除效果好。一般来说聚合物基质的Protein A 因为亲水性问题,HCP 去除效果往往比软胶差,但UniMab可以达到软胶Protein A 的同等水平。
图10 纳微UniMab与对照填料的HCP去除效果
第五,除了创新基球外,纳微又经过多年的努力通过优化组合不同片段的Protein A 设计出有自主知识产权的耐碱性Protein A 配基,并实现大规模生产。最后通过优化偶联工艺成功地生产出世界首个单分散Protein A 亲和介质产品,不仅实现该产品的国产化,而且克服了现有市场上Protein A 介质的主要缺陷。纳微单分散Protein A 介质不仅可以提高抗体的生产效率,降低抗体的生产成本,更是下一代连续层析理想的介质。
亲和层析分离条件影响
ProteinA亲和条件相对简单,无需繁琐参数优化。平衡阶段,盐浓度及pH是两个重要参数。由于ProteinA与抗体分子核心区域主要作用力依靠组氨酸疏水性介导,所以增加平衡盐浓度一般可增加3-5mg载量。pH则通常控制在6-7.5,若低于5.0以下,可能会降低动态结合载量,从而降低了回收率。
上样后清洗是去除结合于填料的宿主蛋白(HCP)及核酸(DNA)等杂质的主要过程。清洗pH较为关键,在抗体分子未清洗掉的前提下,选择尽可能低的pH作为清洗条件,以去除更多的HCP等杂质。若常规pH条件无法奏效,可以加入高盐(1M氯化钠)或添加剂如精氨酸、吐温80、尿素及异丙醇等。pH是洗脱过程中最关键工艺参数,在确保回收率的前提下,尽可能选择更高的pH进行洗脱。较低pH会导致洗脱的抗体浓度过高,产生更多的聚集体。另外,洗脱buffer类型也会对洗脱浓度及杂质含量有影响,如相同pH的柠檬酸洗脱强度高于醋酸。
表4 不同Buffer洗脱液效果比较
缓冲液 | 洗脱体积 (ml) | 洗脱浓度 (mg/ml) | 收率 (%) | HCP (ppm) |
洗脱液20mM HAc pH3.5 | 4 | 6.5 | 91.5 | 129 |
洗脱液20mM Gly pH3.5 | 6 | 3.8 | 80.3 | 167 |
洗脱液20mM Citric pH3.5 | 3.7 | 7.3 | 95.1 | 86 |
另外,洗脱液加入精氨酸、氯化钠、聚乙二醇、尿素、组氨酸、咪唑等皆有助于减缓低pH的破坏作用,提高洗脱液纯度。下图是UniMab50纯化过程中在淋洗及洗脱步骤加入了1%聚乙二醇PEG3350,SEC纯度提示PEG可显著降低聚集体含量。
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