近日,台湾国立东华大学彭文平教授团队开发了一种基质辅助激光解吸/电离(MALDI)样品制备新方法——强制干燥液滴法(FDD),可以克服传统干燥液滴(DD)法的缺点。由DD方法产生的晶体是不均匀的并且不规则地分布,因此许多方法试图解决这些问题。但是,大多数人花费了更多时间或需要额外的仪器来产生均匀微晶。FDD样品制备方法可以在几分钟内产生尺寸均匀分布的微晶,无需额外的仪器。相关研究成果已经发表在Analytica Chimica Acta上。
基质辅助激光解吸/电离(MALDI)是由Tanaka、Karas和Hillenkamp于1988年开发的,是分析宽质量范围生物分子(包括肽、蛋白质和合成聚合物)的重要工具。为了制备MALDI样品,已经引入了几种方法:干滴(DD)法,真空干燥结晶法,快速蒸发法,覆盖层(例如双层,多层)法,夹层法,基质升华/重结晶法,慢结晶法( 生长大晶体)方法,固/固晶体压缩方法,基质–混合基质样品制备方法等。
DD方法是制备MALDI样品最常用的方法,因为它的样品制备很简单,可以为许多不同类型的样品产生良好的结果。然而,它需要手动搜索分析物掺杂的基质晶体以产生高质量的质谱,因为不均匀的斑点会导致靶板上的不均匀晶体尺寸分布,即“热/甜”点。在这方面,DD方法被认为对于定量应用是不切实际的。为了解决样品晶体分布不均匀的问题,下面的方法被开发出来。真空干燥结晶方法是DD方法的修改版本。样品点在真空室中快速干燥,从而通过降低偏析效应来改善晶体均匀性。然而,该方法并不总是改善DD方法的离子信号,并且还需要真空设备来制备样品。快速蒸发(FE)方法和双层(TL)方法都可以在几分钟内制备样品。FE法不能重现蛋白质混合物样品间的数据,而TL方法具有更好的样品间重现性,因此,普遍采用TL方法为大规模和高通量应用制备均匀的样品表面。然而,对于TL方法,需要一定类型的有机溶剂和pH调节剂来改变第二层溶剂条件以获得所需的结果。夹层法源自FE和TL方法,将最小检测水平扩展到阿摩尔范围。分析物夹在快速蒸发的仅基质床和第二基质层之间。需要手动移液或使用机器人技术的额外步骤。基质升华法需要升华基质以在样板上产生均匀的小晶体层。这种方法需要更长的时间(约1小时)来准备样品表面,需要在高温下操作(110~190 ℃)和压力设置。慢结晶方法可以从复杂混合物(如多肽)的高质量组分中获得优异的质谱,但大晶体的生长需要数小时。与FE和TL方法相比,固/固压缩(晶体破碎)方法需要更多时间。基质/共基质样品制备方法需要适当选择不同的基质组合。最近,通过改变基板温度还引入了基于电润湿的e-MALDI样品制备方法以及干燥液滴内的Marangoni流动以降低空间不均匀性,但是这两种技术都需要特定的仪器来制备样品表面。
在彭文平教授的研究中,开发了强制干燥液滴法(FDD)来克服DD方法面临的不均匀的粒度分布问题。与试图形成均匀晶体的其他方法相比,FDD方法简单,直接且省时。它可以通过触发二次成核在样品表面上产生均匀的分析物-基质晶体,二次成核是通过采用外部物理力实现的,即用移液管尖端搅拌样品点溶液。搅拌样品点溶液(搅拌过程)与二次核形成的速率相关。由于样品的结晶是通过外部物理力实现的,因此该方法称为强制干燥液滴法(FDD)。
CHCA基质与肌红蛋白样品表面显微镜图像,(a)DD方法,(b)TL方法,和(c)FDD方法。 每个图片的10倍放大图像放在右侧,带有比例尺。
使用(a)DD方法,(b)TL方法和(c)FDD方法将肌红蛋白与CHCA基质混合的质谱。 恒定激光能量~3.9 mJ和1550 V检测器电压用于获取所有方法的质谱。
FDD方法原理:
晶体形成涉及两个连续的步骤:成核和晶体生长。DD方法的样品制备中的晶体形成不同于FDD方法的晶体形成。对于DD方法,分散在过饱和溶剂中的溶质基质分子在溶液中自发形成核;随后,晶核变成晶体。然后,在存在过饱和的同时,成核和晶体生长继续同时发生。晶体生长比成核过程快,这导致了大尺寸晶体的形成。对于FDD方法,搅拌溶液(搅拌过程)诱导母核并随后进行初级晶体生长。连续搅拌使初级晶体破裂并使溶液中的细颗粒发生摩擦。这些细颗粒为二次成核提供了活性位点。二次成核的有效速率取决于细颗粒产生速率和成核效率。
该研究通过显微镜成像确认搅拌对样品表面微晶生长的影响。在整个样品表面区域,微晶的尺寸小于10μm。与标准DD法和TL法相比,使用这种新的FDD方法的质谱和样品表面的显微图像都表明形成了均匀的分析物-基质晶体。与DD方法相比,使用FDD方法,发现用芥子酸基质离子强度增加约3~5倍,或用α-氰基-羟基肉桂酸基质增加7~10倍。此外,用FDD方法得到的质谱与TL方法具有可比性,可用于蛋白质样品的大范围质谱分析。
研究结果表明,用移液管尖端搅拌样品点溶液(搅拌过程)可以改变显微镜观察到的晶体尺寸分布。FDD方法可以产生致密且均匀分布的分析物-基质微晶,尺寸小于10μm。通过FDD方法形成微晶与二次成核的有效速率有关,而二次成核的有效速率取决于细颗粒的产生速率和成核效率。它也是检测具有良好离子信号的宽质量范围蛋白质的有效方法。质谱分析表明,晶体尺寸越小,离子信号强度越好。FDD方法的相对标准偏差(RSD)为~16%,与两层(TL)方法相当,优于DD方法。此外,不像TL方法,FDD方法不需要额外的层(种子层),因此,它是直接、简单和快速的(约3分钟)。用FDD方法,分析物-基质晶体可以均匀分布在整个样品点上。因此,FDD方法可用于MALDI TOF-MS的定量应用。
样品前处理一直是制约着MALDI质谱技术应用和发展的因素之一, 而基质在待测样品上分布的均匀度、结晶度和晶体颗粒的大小等因素决定着质谱成像的质量。要尽可能的满足基质能与待测物形成良好的共结晶,均匀分布,且其颗粒大小越小越好,以协助目标分子的高效电离。彭文平教授团队研究出的FDD样品制备方法,可以产生致密且均匀分布的分析物-基质微晶,尺寸小于10μm,可用于MALDI TOF-MS的定量应用。
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FDD法如果能与融智生物QuanTOF平台的卓越性能相结合,相信MALDI质谱分析技术一定能获得更好的分析结果。
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