01
研究背景
膜蛋白生命活动中具有重要作用,也是重要的药物靶点,而膜蛋白在进行互作研究过程中会有许多难点:
1. 膜蛋白一般需要去垢剂来模拟脂质生物环境。对于基于固定的互作技术,去垢剂会增加背景信号,或者存在参比通道和样品通道背景不同的可能。
2. 膜蛋白结构复杂,且与配体结合后可能发生变构。因此研究互作时,膜蛋白的正确构象至关重要。基于固定的技术可能阻碍变构过程,或者在固定和再生过程中破坏膜蛋白的构象。
3. 膜蛋白的表达量低、纯化难,因此需要消耗量少的方法进行检测。
本期文献解读,讲述如何利用MST及nanoDSF的手段来进行膜蛋白互作研究的故事。
02
研究内容
2024年3月15日,上海科技大学张璐研究员/饶子和院士团队在Nature Microbiology发表题为“Structural analysis of phosphoribosyltransferase-mediated cell wall precursor synthesis in Mycobacterium tuberculosis”的研究,解析结核分枝杆菌全新药物靶标——膜蛋白磷酸核糖转移酶Rv3806c与其受体底物DP和供体底物PRPP结合复合物的精细三维结构,为研究Rv3806c作为新靶点的靶向性药物研发提供了重要的理论基础。
https://doi.org/10.1038/s41564-024-01643-8IF: 28.3 Q1
通过对Rv3806c与供体底物PRPP复合物结构分析,推测可能影响Rv3806c结合和酶活的位点,并通过MST进行大量突变Rv3806c亲和力检测进行验证。
Rv3806c为膜蛋白,并且在脂质环境中以三聚体形式组装。实验种共有10种突变体需进行Kd检测,每次实验均进行了5次重复。
MST进行一次亲和力检测时,仅需32pmol、1μg的膜蛋白Rv3806c,大大节约蛋白消耗量。此外,MST技术是在溶液条件下进行,无需固定,且兼容去垢剂,使膜蛋白能保持正确的构象,甚至可以完成nanodisc或者膜提取物形式的膜蛋白亲和力检测,从而可以轻松表征膜蛋白Rv3806c多种突变体与底物PRPP的亲和力。
图示:MST测定PRPP与WT-Rv3806c及突变体的结合亲和力
此外,研究发现,供体底物PRPP通过一个Mg2+结合在TM螺旋束-1的空腔。为了研究Mg2+对Rv3806c结合供体底物PRPP的作用,作者使用MST和nanoDSF技术检测存在或不存在Mg2+时,Rv3806c与底物PRPP的结合。
NanoDSF技术通过监测蛋白内源荧光的变化来表征蛋白结构,无需加入外源荧光染料,兼容去垢剂。使用GDN纯化的Rv3806c完成MST亲和力实验和nanoDSF的热迁移实验,结果显示Mg2+对于PRPP的结合至关重要。
图示:MST分析在Mg2+存在或不存在的情况下,PRPP与Rv3806c的结合亲和力。在没有Mg2+的情况下,结合亲和力急剧下降,而在金属螯合剂EDTA的存在下,没有检测到结合。
图示:在Mg2+、PRPP和EDTA存在或不存在的情况下,纯化后的Rv3806c的nanoDSF热稳定性分析。PRPP-Mg2+存在时Rv3806c表现出最高的热稳定性。
03
技术优势
在这篇工作中,通过MST技术及nanoDSF技术,确定了膜蛋白Rv3806c与PRPP结合的关键残基,以及Mg2+在互作过程中的关键作用。对于分子互作亲和力的检测,Monolith系列仪器无需固定样品,且不限制缓冲条件,蛋白用量少,可以在溶液中表征膜蛋白与小分子的亲和力。
Promethus系列仪器,以nanoDSF技术为核心,通过检测蛋白内源荧光监测蛋白的稳定性,无需外源荧光染料,兼容去垢剂,低浓度也可轻松表征,在膜蛋白稳定性分析和TSA互作定性研究上具有显著优势。
-Monolith分子互作检测仪-
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