干货满满！看 Panta 轻松预测 ADC 稳定性

诺坦普科技（北京）有限公司

2024/06/20 10:50

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话题介绍

如何预测稳定性实验？

对于ADC研发人员来讲，通过进行一系列蛋白质评估将有助于降低早期开发过程中最终产物不稳定的风险，特别是在优化偶联过程中，这些评估策略显得尤为重要。

在本期文章中，我们来重点讲讲如何进行预测稳定性实验。借助PR Panta蛋白稳定性分析仪来推断低浓度样本在提高剂量, 并在更高浓度下用于临床给药后的表现。因为，这对于降低筛选过程的风险和确保筛选过程中获得最稳定的候选分子至关重要。

一起看看PR Panta提供的真实数据示例，它们比较了裸抗--Trastuzumab（或称Herceptin），与ADC药物分子Kadcyla，和另一种来源于同类裸抗的ADC药物分子 RC48之间的多个维度预测信息。

实验

热稳定性实验背景

首先，很重要的第一步，我们要先了解标准的热稳定性实验。在PR Panta上进行这些实验很简单，使用相同的样本收集信息，根据候选分子的热稳定性（如T_m和T_on）以及通过PDI、T_size和T_agg的胶体稳定性参数对其进行排名。

简单地说，首先比较每种的热变性曲线。

Herceptin，裸抗，具有最高的热稳定性，与ADC药物分子Kadcyla相比具有更高的T_m1和更清晰的变性展开转变

Kadcyla和RC48都表现出T_m1的峰增宽，表明大多数药物与该展开转变相关的结构域缀合--这是个好现象，因为T_m1对应CH2结构域，而T_m2和T_m3分别是Fab结构域和CH3--尽管它们通常很接近，仅显示单个T_m2

RC48是一种由另一个母版裸抗构建的ADC药物，与Kadcyla相比，T_m1略有进一步降低。此外，可以判断它是一种与Herceptin不同的裸抗，因为变性展开的曲线轮廓有很大的变化，包括分别展现出的T_m2和T_m3

PR Panta高分辨率的热变性展开数据，对每个ADC或mAb的变性结构展开提供了高度精细的分辨率，使其能够在结构域水平上体现出低至0.2°C的差异。

这三种药物都经过了优化，可用于临床，因此稳定性的变化是最佳的，不像在开发过程的早期，需要比较候选药物分子--比如，需要筛选不同的偶联策略。因此，这些数据是了解偶联过程如何影响ADC稳定性的好方法。

实验

预测数据:3个实验了解ADC

当我们已经了解了热变性曲线的数据，接下来是时候看看PR Panta可以解锁的预测参数了。

自缔合

自缔合参数k_D和第二维里系数B₂₂都是告知生物在高浓度下可能如何表现的参数。其中任何正值都表明药物分子不太可能自我缔合--这是一个理想的结果。自缔合会导致聚集和高粘度，由于许多治疗方法在临床上是以高浓度给药，因此，最好在开发过程的早期就了解ADC是否容易发生自缔合。

自缔合参数k_D

自缔合参数k_D是利用PR Panta的DLS检测模块导出的关于扩散常数的信息，来评估分子与自身相互作用的可能性。正k_D表示排斥力（这是好的）；负k_D是有吸引力的（要避免）。数据显示：

裸抗（mAb）具有高度自排斥性，表现出具有强趋势线的正k_D。这意味着它不太可能在高浓度下的发生自缔合。在PR Panta中表征的数据结果与其他已发表的数据结果一致

Kadcyla也有正k_D，尽管它没有那么强的自我排斥。然而，它仍然被认为是一个“好”的结果，k_D为正

RC48表现出自缔合的倾向，k_D为负

第二维里系数B₂₂

第二维里系数B₂₂是利用PR Panta的SLS检测模块得出的，是着眼于整体情况下自身相互作用的强度。尽管B₂₂和k_D之间存在关系，但它们是相互独立的进行判断，因此并不总是完美地一致。SLS的散射数据在用于低浓度样本下更容易出错。然而，一些研究人员更喜欢B₂₂而不是k_D，因为B₂₂的数据被认为是对样本内相互作用的更“全局”的测量。

如下图所示， B₂₂的趋势看起来与k_D的趋势非常相似。

PR Panta数据计算出的Herceptin自缔合数值较好地反映了文献值，所提供的自缔合数值为您的分子，在放大工艺生产之前，提供了更宝贵的预测信息。

动力学稳定性

动力学稳定性实验，着眼于表征以不同的升温速率设置热变性展开实验时，候选分子的热稳定性行为。通过测量蛋白质随着热升温速率的变化而展开的速度，可以计算出展开的活化能。只需以不同的速率设置一系列热变性曲线，然后比较熔化展开温度如何随速率变化即可。

之后，使用Arrhenius方程，将这些信息用于预测构建的分子在不同储存温度下的半衰期。

这三位候选分子的比较情况：

•显示动力学稳定性Herceptin > Kadcyla > RC48，这与自缔合行为趋势相呼应

•与Herceptin相比，Kadcyla的半衰期显著缩短，但仍在两个月左右

•RC48的半衰期非常低，表明偶联方法极不稳定

62°C下的等温稳定性

等温稳定性是进行加速稳定性研究的另一种方法。与动力学稳定性实验类似，可以使用高温下较短时间的稳定性来推断-20°C、4°C或RT（室温）下的长期稳定性。

我们可以看到候选分子的变化趋势：

•根据累积半径（Cumulant radius，即纵坐标），可以明显检测到轻微的去折叠展开的变化

•在62°C下800分钟（13小时以上）后，Herceptin没有明显的大小变化

•两个ADC有着显著尺寸变化，RC48有着更明显的大小变化，再次表明它是所有候选分子中最不稳定的

实验

总结

以上结果展示了除热变性试验参数外，PR Panta提供的其他多维度参数，对于预测长期稳定性是极有价值的。在早期开发和风险评估期间， PR Panta提供了关于如何选择的最佳候选药物的额外预测信息，可以用于进一步推进药物开发。并且与许多其他下游分析技术相比，PR Panta所需的样本更少，因此，从预测分析进而深入了解偶联过程对ADC的影响，PR Panta将会是研究者优先考量的选择。

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