Stable感受态细胞

Stable感受态细胞

Stable Chemically Competent Cell 产品说明书 

产品规格（CAT#: LM1080）

Stable：                                                     100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                   10μl

保存条件(保质期)：                            -80℃（6个月）

Stable感受态细胞基因型

F' proA+B+ lacI^q ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (Tet^R) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14- Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (Str^R) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS -mcrBC) 

产品说明

Stable菌株是NEB公司开发的高转化效率菌株，是逆转录病毒/慢病毒载体系统推荐使用的菌株，特别适合慢病毒或具有末端重复序列DNA片段的克隆。基因组含有重组酶recA1 rel A1突变，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率；同时含有核酸酶endA1突变，避免了提取质粒过程中核酸酶的污染，大大提高了高纯度病毒质粒的产量和质量。lacZΔM15的存在使Stable可用于蓝、白斑筛选，此菌株具有四环素和链霉素抗性，Stable感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19检测转化效率>5×10⁸ cfu/μg DNA。 

Stable感受态细胞操作方法

1. Stable感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，6分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置5分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入0.9 mL室温S.O.C.或LB培养基(S.O.C.营养丰富，可提高转化效率)。

4. 30℃，250 rpm复苏60分钟。

           当质粒中含有不稳定片段时，30℃培养可降低错误重组的概率，若转化control pUC19计算转化效率

           则需37℃，225 rpm复苏60分钟

5. 筛选平板提前拿出放30℃孵育使平板温度保持30℃，吸取50-100 μl直接涂筛选平板或5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的S.O.C.或LB培养基上。

6. 将平板倒置放于30℃培养20-24小时或37℃过夜培养。

当质粒中含有不稳定片段时，30℃培养可降低错误重组的概率，若转化control pUC19计算转化效率，

则需37℃培养过夜

Stable感受态细胞注意事项

1. 对不稳定DNA片段的克隆或逆转录病毒/慢病毒载体的构建，涂板后平板应在30℃培养，以减少发生错误重组的概率

2. 制备高纯度病毒质粒时，应使用新鲜转化的平板接菌，新鲜菌液提取质粒，菌液不可低温保存后使用。

3. 对不稳定的克隆或病毒质粒优先以质粒状态保存，尽量避免将质粒保存在大肠杆菌细胞中。

4. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中10分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。混入目的DNA时应轻柔操作。

5. 转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

同一批感受态细胞，用含目的片段的T载体质粒转化（阳性对照）能长出密密麻麻的菌落，而用另一种载体和目的片段的连接产物转化，却一个菌都没长出来，重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关，还是连接出了问题？哪个可能性大些？

答：应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照，确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。

感受态细胞放到-80冰箱了有半年了，还能用来转化质粒吗？

答：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。