ClearColi K12 Electro感受态细胞

ClearColi K12 Electro感受态细胞

ClearColi K12 Electroporation-Competent Cell产品说明书

产品规格（CAT#: LM2040）

ClearColi K12 Electro  Cell                                       50μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                               10μl

恢复培养基                                                               50ml/瓶

保存条件(保质期)：                                        -80℃（6个月）

ClearColi K12 Electro感受态细胞基因型

F^–λ^–?endA^–?recA^–frr181 msbA52 ?gutQ ?kdsD ?lpxL ?lpxM ?pagP ?lpxP ?eptA

ClearColi K12 Electro感受态细胞产品说明

ClearColi K12电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。ClearColi K12菌株来源于K12 endA- recA-菌株。在K12 endA- recA-菌株中引入突变，导致ClearColi K12细胞壁外层的脂多糖（LPS）被修饰:LPS的低聚糖链被删除，同时LPS的两个酰基链也被删除，进而破坏了ClearColi K12大肠杆菌的内毒素信号通路，使得从该细胞中提取的蛋白或质粒DNA中的内毒素含量极低，提取的无内毒素质粒广泛应用于后续的哺乳动物细胞转化。ClearColi K12同时缺失核酸内切酶 (endA)和重组酶 (recA)，提高了质粒DNA的产量和质量。唯地生物开发的ClearColi K12电击感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率可达1×10⁷ cfu/μg DNA。

ClearColi K12 Electro感受态细胞操作方法

1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的ClearColi K12电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA ，并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。

    A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；

    B. 对于未知来源或组分不明的质粒DNA，请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM              EDTA)重悬，DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。

3. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。

4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。

5. 2分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入1ml不含抗生素的无菌恢复培养基（室温），用1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml锥形离心管等），向离心管中补加恢复培养基（室温）至10 ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。

6. 5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的LB（务必使用高盐培养基平板，不可用2YT，SOB，SOC等低盐培养基）平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱中培养36-48小时（培养24小时后可看到很小的克隆）。

LB培养基1L(PH:7.0):                 

Yeast Extract     5g                       

NaCl           10g

Tryptone        10g

注意事项

1. 因ClearColi K12细胞壁外层的脂多糖（LPS）被修饰，细胞易死亡，不易保存，平板菌在4度存放时间应不超过1周。且适合在高盐培养基中生长。

2. ClearColi K12电击感受态效率很低，不适用于构建质粒使用，一般用来扩繁质粒，提取高质量的无内毒素的质粒；若构建质粒，请选用DH5a、TOP10等转化效率较高的感受态细胞。

3. ClearColi K12菌株生长缓慢，平板在37度培养时间在36-48小时之间。

4. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。

5. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。

6. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。

7. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

8. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

9. 对于连接产物转化，最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。

10. ClearColi K12菌株的细胞壁被修饰过，细胞比较脆弱，混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少用于涂板的菌量。

11. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。

同一批感受态细胞，用含目的片段的T载体质粒转化（阳性对照）能长出密密麻麻的菌落，而用另一种载体和目的片段的连接产物转化，却一个菌都没长出来，重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关，还是连接出了问题？哪个可能性大些？

答：应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照，确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。

感受态细胞放到-80冰箱了有半年了，还能用来转化质粒吗？

答：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。