BJ5183-AD-1 Electro感受态细胞

BJ5183-AD-1 Electro感受态细胞

BJ5183-AD-1 Electroporation-Competent Cell 产品说明书

产品规格（CAT#: LM1076）

BJ5183-AD-1 Electroporation-Competent Cell             50μl/支

pCAMBIA2301 (control vector, 10ng/μl):                            10μl

保存条件(保质期)：                                                -80℃（6个月）

BJ5183-AD-1 Electro感受态细胞基因型

endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (Str^R) [pAdEasy-1 (Amp^R)] 

BJ5183-AD-1 Electro感受态细胞产品说明

BJ5183-AD-1是携带了腺病毒质粒pAdeasy-1的BJ5183菌株。BJ5183菌株是一种具有较高重组活力的大肠杆菌菌株，是目前腺病毒系统最常用的感受态细胞。BJ5183菌株含有sbcBC recBC双重突变，赋予BJ5183细胞较强的重组能力，有利于转入的目的基因与腺病毒骨架质粒的重组。endA1（缺失核酸内切酶）的突变有利于重组DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。BJ5183-AD-1菌株细胞中已经提前转入了腺病毒质粒pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3 deleted)]，赋予该菌株氨苄抗性，在病毒质粒构建时，只需转入线性化的目的质粒即可，简化了实验步骤，提高了病毒质粒重组概率。Str^R 赋予BJ5183-AD-1菌株链霉素抗性。BJ5183-AD-1电击感受态细胞适用于普通质粒和大质粒的构建，经特殊工艺制作，pCAMBIA2301质粒(size:1163bp)检测转化效率>1×10⁶ cfu/μg DNA。

BJ5183-AD-1 Electro感受态细胞操作方法

1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙

醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中

静置5分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的BJ5183-AD-1电击感受态细胞插入冰中5分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。

A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒pCAMBIA2301；

B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重

悬，DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。

3. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。

4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用

电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。

5. 2分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基（室温），用1ml

枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml锥形离心管等），向离心管中

补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。

6. 5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，

若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

S.O.C 培养基配方

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM glucose

PH-7.0

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain

maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).

注意事项

1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。

2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。

3. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。

4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

6. 对于连接产物转化，最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。

7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。

同一批感受态细胞，用含目的片段的T载体质粒转化（阳性对照）能长出密密麻麻的菌落，而用另一种载体和目的片段的连接产物转化，却一个菌都没长出来，重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关，还是连接出了问题？哪个可能性大些？

答：应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照，确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。

感受态细胞放到-80冰箱了有半年了，还能用来转化质粒吗？

答：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。