F-BL21(DE3)感受态细胞

F-BL21(DE3)感受态细胞

F-BL21(DE3) Chemically Competent Cell 产品说明书

产品规格 （CAT#: LM1002）

F-BL21(DE3)：                                            100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                    10μl

保存条件(保质期)：                             -80℃（6个月） 

F-BL21(DE3)感受态细胞基因型

F^- ompT hsdS_B(r_B^- m_B^- ) gal dcm(DE3)

F-BL21(DE3)感受态细胞产品说明

BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。λ噬菌体DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶，该区整合于BL21的染色体上，所以称为BL21(DE3)。可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。

F-BL21(DE3)感受态细胞经特殊工艺制作，无需42℃热激，37℃孵育步骤，只需冰浴，10min内完成转化、涂板操作，pUC19质粒检测转化效率可达1×10⁷ cfu/μg DNA。

 快速转化操作方法（10min）

1. 提前10分钟将用到的筛选培养基平板拿到37℃预热。

2. F-BL21(DE3) 感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰中静置5分钟。

3. 用200 μl枪将感受态细胞-DNA混合物转移到已经37℃预热的LB培养基上，涂均匀，表面无水渍。

4. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

快速热激转化操作方法（25min,可提高转化效率）

1. F-BL21(DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA并用手拨打EP管底轻轻混匀,，冰中静置5分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟（晃动会降低转化效率）。加入700 μl不含抗生素的LB，37℃，200 rpm 复苏10分钟，涂板（均匀，表面无水渍）。

3. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

F-BL21(DE3)感受态细胞注意事项

1. F-BL21(DE3) 感受态细胞也可进行热激操作，对于>7 kb质粒的构建，为了提高转化效率可按以下步骤操作：感受态细胞从-80℃拿出，插入冰中，5分钟后，加入目的DNA并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰中静置10分钟。42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中静置2分钟。加入700 μl LB，37℃，200 rpm复苏30分钟，涂板。

2. F-BL21(DE3) 快速转化感受态细胞涂氨苄/羧苄青霉素抗性平板时效率较高，若涂卡那霉素或其他抗生素平板，转化效率下降(因无孵育步骤，卡那霉素等对菌体毒性较大)。若要提高卡那霉素或其他抗性质粒的转化效率，可按热激转化操作，增加孵育步骤。

同一批感受态细胞，用含目的片段的T载体质粒转化（阳性对照）能长出密密麻麻的菌落，而用另一种载体和目的片段的连接产物转化，却一个菌都没长出来，重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关，还是连接出了问题？哪个可能性大些？

答：应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照，确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。

感受态细胞放到-80冰箱了有半年了，还能用来转化质粒吗？

答：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。