EAAT4蛋白；兴奋性氨基酸转运蛋白4(EAAT4)重组蛋白

EAAT4蛋白；兴奋性氨基酸转运蛋白4(EAAT4)重组蛋白

英文名称：Recombinant Excitatory Amino Acid Transporter 4 (EAAT4)

SLC1A6; Solute Carrier Family 1 Member 6,High Affinity Aspartate/Glutamate Transporter; Sodium-dependent glutamate/aspartate transporter

来源：原核表达

宿主：E.coli

规格：10μg   50μg   200μg   1mg   5mg

内毒素水平：<1.0EU/μg(LAL法测定)具体详见说明书

片段与标签：Gly156~Asn264 with N-terminal His Tag

物种来源（人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猕猴、山羊、绵羊、马、牛、猪、鸡、狗等其他物种多物种）相同的名称，不同的物种。

性状：冻干粉

表达系统：    大肠杆菌

产品纯度：>95%-98%（SDS-PAGE & RP-HPLC）

保存条件：如果样品在2-4周内使用，可以在4°C低温储存。

EAAT4蛋白；兴奋性氨基酸转运蛋白4(EAAT4)重组蛋白有几个疑点：

1、表达量如何？

2、超声过程中注意冰水浴了吗？

3、“蛋白条带由1条变成3条”是不是说表达后的全菌电泳目标蛋白是一条带，而在超声或溶菌酶处理后这1条带降解成了3条？

4、降解成的3条带中还有原来的融合蛋白条带吗，量如何？

5、变性纯化后的纯度如何？

6、能否把相关电泳图发上来看看？

答：蛋白表达量不高，但也不低；

超声过程一直是在冰上进行的；

全菌电泳目的蛋白是一条带；

降解成3条带后，大部分情况下是有目的融合蛋白的，量比较少；

变性纯化后纯度还是挺不错的。

EAAT4蛋白；兴奋性氨基酸转运蛋白4(EAAT4)重组蛋白两个建议：

1、用非变性纯化样品去做EK酶切、纯化。

如果融合蛋白的降解是从N端开始的，而C端没有降解，那么应该能够拿到38肽。

我曾经有个这么个类似情况，酶切后证实是N端降解，C端的目的蛋白好好的，大小都对。

做EK酶切多了，往往会发现，PET32a的融合段硫氧还蛋白加histag部分确实易被进一步酶切水解。但Ni柱的结合特性不变，说明水解是从N端开始的。

先做酶切梯度，电泳确定酶量标准。不要用酶说明书的量，有时候差距非常大。和蛋白种类相关。

酶切后的纯化方法选Ni柱穿透纯化，可能要加少许咪唑及盐，以利用酶切后的目标蛋白不吸附Ni柱。

2、用变性纯化的样品做复性处理

EAAT4蛋白；兴奋性氨基酸转运蛋白4(EAAT4)重组蛋白变性纯化的样品纯度不错，查阅一下有关的复性方法资料，设计一个方案。

你用超滤和透析的方法都失败了，可以考虑用稀释的方法，控制终蛋白浓度小于0.1mg/ml，蠕动泵滴入搅拌的稀释液中，pH控制高的，如pH9-10，适当加一些甘油和EDTA，DTT。

影响蛋白原核表达的因素很多，如蛋白的亲水性、密码子的稀有性、蛋白毒性等。如疏水性过强，就难以表达；稀有密码子过多或多个稀有密码子连在一起也难以表达。我以前也遇到过这种情况，首先要分析你的蛋白序列和二级结构，看看是否存在这些影响因素。如果必须要表达全长蛋白，像你这种情况难度就比较大，可以进行密码子的改造，或者更换载体，或者更换宿主菌。看你试验的目的，如果不需要表达全长蛋白，如表达部分抗原性强的片段，可以简单一点，表达部分片段即可。