DNA Shuffling试剂盒

报价:¥2990
供货周期: 现货
品牌: LMAI Bio
型号: 10次
货号: LM-F263
上海联迈生物工程有限公司
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产品详情

DNA Shuffling试剂盒

产品及特点DNA Shuffling 即 DNA 分子的体外同源重组,它是一种分子水平上的定向进化(directed evolution)技术,它以一个或多个基因为起始材料,通过先随机断裂成小片段,再进行互为模板和引物的 PCR(无外加引物),后再进行常规PCR(外加引物)等处理,后得到含有大量 DNA 重组突变的 PCR 产物。其原理示意图如下:

本产品就是根据上述原理优化改进而成,它具有下列特点:

1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板,无需单独准备各成分。

2. 可以用于对长度在 1000bp 的同源片段进行 shuffling。

3. 操作手册经过优化,1-2 天即可完成,节省大量优化时间。

4. 本产品足够 10 次 DNA Shuffling 反应,只适用于科研,不能用于临床。
规格及成分 成分 编号 十孔盒包装
PCR MagicMix LM90805 1 mL×3
DNase I 溶液(0.1U/μL) LM90903a 10 μL
DNA Shuffling 试剂盒溶液 A,10× LM131178a 100 μL
DNA Shuffling 试剂盒溶液 B,10× LM131178b 100 μL
超纯水 LM100935 1 mL
使用手册 LM131178sc 1 份

运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限一年。

自备试剂 待突变基因片段、DNA Shuffling 引物(第二轮 PCR 引物)、胶回收试剂盒。

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使用方法 

1. 提前开启 37℃和 75℃水浴或金属浴。

2. 待突变基因片段的制备:待突变基因片段可以用多个含同源片段的质粒为模板、用 PCR 法或酶切法制备。制备时需保证含起始同源片段(或此同源片段的一部分)的 DNA 片段总长度要比 DNA shuffling 终产物(第二轮 PCR产物)长 200-400 bp,即第二轮 PCR 的引物位置要在此步模板制备引物内侧 100-200bp,第二轮 PCR 产物的长度在 1000bp 以下。每次 DNAShuffling 实验至少需要 2 μg 起始同源片段(如果含两个以上同源片段,则彼此的比例为 1:1:1),最多可以使用 5 μg 起始同源片段,并且必须通过胶回收的方法回收,以便彻底去除残留的质粒模板、引物和非特异扩增产物等(如果不去除此步的引物,其将对后续 PCR 造成严重干扰)。后需用分光光度法准确定量,此溶液即为同源片段,放冰上待用。

3. 准备 DNase I 工作液,将 1 μL 本试剂盒提供的 DNase I 溶液、8uL 超纯水、1 μL DNA Shuffling 试剂盒溶液 A 混合得 DNase 工作液,放冰上待用。DNase 工作液必须现配现用。

4. 设置同源片段碎片化反应:在一个 PCR 管中,按顺序加入下列成分:

成分 用量

同源片段(来于两个以上不同基因) 2-5 μg

DNA Shuffling 试剂盒溶液 A,10× 5 μL

DNA Shuffling 试剂盒溶液 B,10× 5 μL

DNase 工作液 2 μL

补超纯水到 50 μL

5. 充分轻柔吹打混匀后 37℃水浴 8 分钟,然后立即放 75℃水浴处理 10 分钟以灭活 DNase I。

6. 在 2-3%琼脂糖凝胶上电泳,用常规的胶回收法回收 25-150 bp 范围的所有片段,分光光度法精确测定回收片段的浓度。此即为回收片段,放冰上待用。注意:一定要加合适的 DNA marker 以便确定片段范围。

7. 回收片段重组反应:在一干净 PCR 管中加入 0.5 μg 回收片段、50 μL PCRMix 3.0、补加超纯水到 100 μL。反应总体积为 100 μL

8. 按下面的 PCR 反应参数进行一轮无引物 PCR:

过程 温度 时间

PCR 前变性 94℃ 150 s

PCR 反应

(40 循环)

94℃ 30 s

47.5℃ 45 s

72℃ 10 s,每次循环后增加 5s

PCR 后延伸 72℃ 10 min

9. 取 5-10 μL 进行电泳检测(本 PCR Mix 含上样成分,可以直接上样。红色示踪剂的泳动速度相当于 50bp DNA),然后对预期长度区域的 PCR 产物进行回收(如果 Shuffling 的同源区域长度为 800bp,则回收 600-1000bp范围的片段),得到一轮 PCR 回收产物。

10. 留部分一轮 PCR 回收产物之后,用超纯水将其分别稀释 10 倍、20 倍和50 倍,放冰上待用。

11. 取一轮 PCR 回收产物原液、10 倍稀释液、20 倍稀释液和 50 倍稀释液各 1uL 作为 PCR 模板,按下表设置 4 管第二轮 PCR 反应(100μL 体系)。

成分 1-4 号管

PCR 模板(4 种) 各 1 μL(1 号加原液、2 号加 10

倍稀释液、以此类推)

PCR MagicMix 3.0 50 μL

自备 DNA Shuffling 引物 每管各加 30 pmol

超纯水 加到 100 μL

12. 按下列 PCR 参数进行 PCR:

过程 温度 时间

活化 94℃ 150 s

PCR 反应

(25 次循环)

94℃ 30 s

47.5℃ 45 s

72℃ 60 s,每次循环后增加 5s

PCR 后延伸 72℃ 10 min

13. 电泳检测 4 个 PCR 产物,回收预期大小的 PCR 产物(根据引物位置估计预期大小),用于后续克隆和分析实验(略)。



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