供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
型号: | 25次 |
货号: | LM-F327 |
SuperTOPO-Kan平末端克隆试剂盒
产品及特点 本产品是基于 Topoisomerase 能够在几秒钟之内高速连接 DNA 片段的原理开发的无背景克隆试剂盒,它使用了本公司通过定点突变改良的 TOPO酶,连接效率比野生型更高。本试剂盒具有下列特点:
1. 高效快速,连接反应几乎在几秒钟内完成,连接率几乎达到 100。
2. 适用于具有 A 尾巴的 DNA 片段使用。
3. 无杂带或引物二聚体的 PCR 扩增产物可以不经过纯化直接用于连接反应。
4. 转化时只需要 37℃10 分钟复苏即可涂盘,免去冰浴、热休克和复苏步骤。
5. 零背景,无需 IPTG-X-Gal 蓝白斑筛选,故不需要 IPTG-X-Gal 培养基。
6. 本试剂盒按 10 uL 标准反应体系,有 25 次和 50 次两种规格包装供选择。
7. 提供含 Amp 和 Kan 两种抗性的载体供选择(160686-25A/50A 是含Amp 抗性 TOPO 载体,160686-25K/50K 是含 Kan 抗性 TOPO 载体)。
规格及成分 成 份 编 号 25 次热封袋包装 50 次热封袋包装
SuperTOPO-Amp
Blunt 载体
LM160684-A 25 uL(其一) 50 uL(其一)
SuperTOPO-Kan
Blunt 载体
LM160684-K 25 uL(其一) 50 uL(其一)
连接缓冲液 LM160684B 25 uL 50 uL
M13F 引物 50 uL 50 uL
M13R 引物 50 uL 50 uL
超纯水 100935 1 mL 1 mL
使用手册 1 份
注意:160684-25A/50A 提供 SuperTOPO-Amp Blunt 载体,
160684-25K/50K 提供 SuperTOPO-Kan Blunt 载体。
运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期一年。
自备试剂 DNA 插入片段、感受态细胞、SOC 或 LB 培养基和培养皿(含抗菌素和不含
使用方法
1. PCR 扩增或酶切回收 DNA 插入片段。如果是 PCR 制备插入片段,所用引物不能磷酸化,使用 Taq 系列的 DNA 聚合酶。
2. 电泳检测并相对定量 PCR 片段或酶切回收片段(跟 DNA marker 比较)。并根据插入片段长度和下表确定每次连接反应需要的佳用量:
插入片段长度 佳用量
100-1000 bp 20-50 ng
1000-2000 bp 50-100 ng
2000-5000 bp 100-200 ng
3. 在一个干净的塑料离心管中,室温下(不要放在冰上)设置如下连接反应体系:
成 份 用 量
纯化后的 PCR 产物 不超过 8 uL(详见注意事项)
SuperTOPO-Amp 载体或
SuperTOPO-Kan 载体
1 uL
连接缓冲液 1 uL
超纯水 补到 10uL
的)
注意:如果使用未经纯化的 PCR 产物,则需要加入量不能超过 1 uL,否则 PCR 体系会干扰连接体系。
4. 轻柔吹打混匀后,短暂离心,常温(20-30℃)放置 0-5 分钟。如果在冬天室温低于 20℃,建议使用 25℃水浴或金属浴。注意:连接时间超过 5分钟的话连接效率会降低。
5. 如果当天不转化,可以将离心管放-20℃保存。如果转化,则取 5 uL 连接液加到 50-100 uL 刚刚融化的感受态细胞中,轻柔混匀。注意:本产品要求感受态细胞的转化效率不得低于 5﹡10E7cfu/ug。
6. 如果片段长度小于 2 Kb,则不需要冰浴和热激,直接在离心管中加入 500uL 不含抗菌素的 SOC 或 LB 培养基,然后取 200 uL 涂盘。也可以先3000g 离心 2 分钟后,弃掉大部分上清,只留约 100 uL 左右,然后重悬细菌后全部涂盘在含 Amp(对 SuperTOPO-Amp)或 Kan(对SuperTOPO-Kan)的培养皿上,37℃过夜培养。
7. 如果片段长度长于 2 Kb,则按常规转化方式,先冰浴 2-30 分钟,然后42℃热激 30 秒,冰上防放置 2 分钟,再在离心管中加入 500 uL 不含抗菌素的 SOC 或 LB 培养基,37℃ 250 rpm 培养 60 分钟,然后取 200uL 涂盘。也可以先 3000g 离心 2 分钟后,弃掉大部分上清,只留约 100uL 左右,然后重悬细菌后全部涂盘在含 Amp(对 SuperTOPO-Amp)或 Kan(对 SuperTOPO-Kan)的培养皿上,37℃过夜培养。
8. 用菌落 PCR、直接测序或其他方法鉴定重组子。
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