酿酒酵母Y2HGold化学感受态细胞

酿酒酵母Y2HGold化学感受态细胞

产品及特点酿酒酵母 Y2HGold 是 Clontech 公司开发的 GAL4 系统酵母双杂实验用菌株，MATa 型，可直接转化质粒或与 MATα 型酵母菌株 Y187 通过 mating 操作进行蛋白互作验证或筛 库试验。Transformation marker 为：trp1，leu2，报告基因为：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1。 Y2HGold-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7 和 pGADT7。质粒 pGBKT7 的筛选标志为 TRP1，用于表达 DNA-BD (来自酵母转录因子 GAL4N 端 1~174 位 氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒 pGADT7 的筛选标志为 LEU，用于表达 AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。

GAL4 系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构 域：位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768~881 位氨基酸 区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS， 并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录， 但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常 条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait -BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait和prey发生相互作用，就会促使BD和AD的相 互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y2HGold有四个报告基因：AbAr， HIS3，ADE2，MEL1，分别由三种不同的启动子(G1，G2，M1)启动，这三种启动子只 有GAL4识别的17 bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概 率。此外新报告基因AbAr与以前的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，也可以降 低酵母双杂假阳性发生的概率。

Y2HGold感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检测转化 效率>104cfu/μg DNA。

Y2Hgold的基因型是：MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-Gal1TATA-His3, GAL2UAS-Gal2TATA-Ade2 URA3::MEL1UAS-Mel1TATA AUR1-C MEL1
规格及成分 成分 编号 包装
Y2Hgold 感受态细胞 140390A 0.1 mL×10
PGADT7，10 ng/μL 140390B 10 μL
Carrier DNA，5 μg/μL 140390C 100 μL
PEG/LiAc 140390D 5 mL
使用手册 1 份

运输及保存 感受态细胞干冰运输、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/LiAc 4℃保存；有效 期半年。

自备试剂 目的 DNA、YPDA、 SD 培养基等

使用方法1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100 μL，可以根据 实际情况分装使用。 以下实验以 100 μL 感受态细胞为例。

2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中依次加入 2-5 μg 预冷的目的质粒、10μL Carrier DNA（95-100℃ 5 分钟，快速冰浴，重复一次）、500 μL PEG/LiAc， 吹打混匀，30℃水浴 30 分钟（15 分钟时翻转 6-8 次混匀）。

3. 42℃水浴 15 分钟（7.5 分钟时翻转 6-8 次混匀）。

4. 5000 rpm 离心 40 秒，弃上清。取 400 μL ddH2O 重悬沉淀，5000 rpm 离心 30 秒，弃上清。

5. 取 50 μL ddH2O 重悬沉淀，涂板，29℃培养 48-96 小时。