供货周期: | 现货 |
品牌: | LMAI Bio |
规格: | 15次 |
货号: | LM-F512 |
CAS号: |
植物叶绿体纯化试剂盒
产品及特点叶绿体是重要的,负责植物光合作用的细胞器,很多重要的特性(如雄性不育) 也跟叶绿体相关,所以叶绿体是研究植物生理和母系遗传的重要材料。对植物叶绿 体进行生化,遗传和分子生物学研究都需要进行叶绿体纯化。本产品就是基于密度 梯度离心的,专门用于从植物叶片中纯化完整叶绿体的试剂盒。它具有下列特点:
1. 即用型试剂盒,用户不需要单独配制各种溶液。
2. 提供 AB 两种选择,A 型用于叶绿体粗提,所得叶绿体含少量其他细胞器污染, 可用于后续的 SDS-PAGE,Western,ELSIA 和蛋白组分析。B 型用于叶绿 体精提,所得叶绿体完整,可用于后续的光合作用,电子链和磷酸化,跨膜转 运,体外叶绿体蛋白合成,蛋白定位等研究。还可用于的叶绿体膜,基质,类 囊体,叶绿体 DNA 和叶绿体 RNA 纯化。
3. 本产品足够 15 次提取,每次可处理 30g 叶片,能得到 5 mg 左右叶绿体。
4. 已经成功用于菠菜,大豆,莴笋,白菜,烟草和甜菜等植物,还可用于更多植 物(可能需要优化条件)。
规格及成分 成 份 编 号 大纸盒包装
溶液 A 成分一 LM120308A1 250 mL×2
溶液 A 成分二(干粉) LM120308A2 3 g
溶液 B LM120308B 60 mL
带柄尼龙滤膜 LM120308C 1 个
使用手册 LM120308sc 1 份
运输及保存 常温运输和保存,试剂盒期限一年。
自备试剂 去离子水。
使用方法 注意:叶绿体对温度高度敏感,所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行,所用器皿和溶液均需要在 4℃预冷。离心时一定要在 4℃进行,离心力以 g 而不是 rpm计算。如果需要研究叶绿体的功能,提取过程还需要在昏暗的光线条件下进行。
1. 实验前 1-2 天将植物放在暗室培养以减少叶绿体中淀粉颗粒的形成,否则离心时这些颗粒很容易使叶绿体破裂。叶片在实验前需先用自来水洗净,再用蒸馏水淋洗,去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理,则保存时需要保持叶片湿润,即使如此,叶片的放置时间也不能超过一天。
2. 新鲜(实验当天)制备溶液 A:将自备的去离子水与溶液 A 成分一按 4:1 的比例混合,然后在混合液中加入溶液 A 成分二干粉到终浓度 0.1%(每 100 mL中加入 0.1 g 干粉),摇晃溶解后所得溶液即为溶液 A,冰上预冷待用。一次实验(从 30 g 叶片提取叶绿体)所需要的溶液 A 体积跟材料不同而不同。溶液 A 不能长期保存,需要现用现配。
3. 新鲜采集植物叶片,快速去除叶脉并将叶片剪成 1-3 cm2大小的碎片并浸泡在适量的预冷的溶液 A 中(每克叶片加 4 mL 溶液 A,但对烟草和大豆,每克叶片需要加 6 mL 溶液 A)。
4. 将浸泡了叶片的溶液 A 转移到 Waring 匀浆机(即家用制备果汁的匀浆机)中,低速匀浆 10 秒,避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入匀浆机底部后,再低速匀浆 10 秒。注意:除 Waring 匀浆机外,还可以选择 Dounce 玻璃匀浆器,Polytron 匀浆机和研磨(加玻璃珠)等裂解细胞的方法,但这些方法的单次处理量都比较小,需要将样品分成很多小份单独匀浆,然后再汇集。
5. 用带柄尼龙滤膜过滤匀浆液,可先将滤液收集到预冷的 200 mL 量筒中,再等分到 4 个预冷的 50 mL 的塑料离心管中(每个管中的滤液不要超过 35mL)。带柄尼龙滤膜后可反复使用。
6. 在水平转子离心机上 4℃ 200 g 离心 3 分钟(对菠菜,白菜和莴笋材料)或400 g 离心 1 分钟(对甜菜材料),白色沉淀为未破裂的细胞或细胞核。
7. 将上清液(含叶绿体)转移到一个新的、预冷的 50 mL 塑料离心管中。
8. 在水平转子离心机上 4℃ 1000 g 离心 7 分钟,小心弃上清,沉淀含叶绿体,呈浅绿色。
9. 在沉淀中加入 1.5 mL 预冷的溶液 A,手弹离心管底部使叶绿体重悬。注意:重悬时好避免溶液起泡,也不要用枪头吹打,否则叶绿体容易破裂。沉淀下有白色淀粉属于正常现象,但重悬叶绿体时避免将白色淀粉重悬。
10. 将 4 管叶绿体重悬液汇集(共约 6 mL)。此溶液为叶绿体粗提产物,可直接用于后续的 SDS-PAGE,Western,ELSIA 和蛋白组分析。如果需要以之为材料精提叶绿体,就需要将破裂的叶绿体和完整的叶绿体分开,根据植物的不同,可选用下述两种密度梯度离心法之一进行分离。
11. 单浓度分离法(适合菠菜,白菜和莴笋等材料):
a) 在 50 mL 塑料离心管中先加入 6 mL 溶液 A 成分一和 4 mL 溶液 B,充分混合均匀。
b) 在其液面上小心铺上第 11 步汇集得到的约 6 mL 叶绿体重悬液。
c) 在水平转子离心机上 4℃ 1000 g 离心 8 分钟,最上层的绿色带含破碎的叶绿体,线粒体和核糖体等,管底的绿色沉淀为完整的叶绿体。
d) 小心将上清倒出后,在叶绿体沉淀中加入预冷的 0.5 mL 溶液 A 成分一,手指轻弹管底使之重悬。
e) 将叶绿体重悬液转移到 1.5mL 离心管中并避光保存。可在相差显微镜下检查叶绿体完整性。叶绿体必须尽快使用,否则非常容易失去活性。
12. 双浓度分离法(适合烟草,甜菜和大豆等材料):
a) 在 14 mL 塑料离心管中先加入 0.5 mL 溶液 A 和 2 mL 溶液 B,充分混合均匀,得密度梯度重液。
b) 在另一试管中将 3 mL 溶液 A 和 2 mL 溶液 B 充分混合均匀,得密度梯度轻液。
c) 将密度梯度轻液小心铺在密度梯度重液之上,然后将第 10 步汇集得到的叶绿体重悬液中的 4 mL(还剩下 2 mL)小心铺在密度梯度轻液之上。
d) 在水平转子离心机上 4℃ 3200 g 离心 15 分钟,最上层绿色带含破碎的叶绿体、线粒体和核糖体等,重液和轻液间的绿色带为完整叶绿体。
e) 用广口吸管小心将重液和轻液之间的绿色带(叶绿体)转移到新的离心管
中,加入三倍体积的预冷的溶液 A 成分一,轻柔混匀。
f) 在水平转子离心机上 4℃ 1700 g 离心 1 分钟,小心将上清倒出后,在绿色的叶绿体沉淀中加入预冷的 0.5 mL 溶液 A 成分一,手指轻弹管底使之叶绿体重悬。
g) 将叶绿体重悬液转移到 1.5 mL 离心管中并避光保存,也可在相差显微镜下检查叶绿体完整性。叶绿体必须尽快使用,否则非常容易失去活性。所得精提叶绿体可用于后续的光合作用,电子链和磷酸化,跨膜转运,体外叶绿体蛋白合成,蛋白定位等研究。还可用于的叶绿体膜,基质,类囊体,叶绿体 DNA 和叶绿体 RNA 纯化。
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