AFLP试剂盒（EcoRI-MseI）

AFLP试剂盒（EcoRI-MseI）

产品及特点AFLP（amplified fragment length polymorphism）原理是一种结合 RFLP 和 PCR 技术特点的、迄今为止最有效分子标记分型技术，其原理如下：本产品在传统 AFLP-PCR 的基础上经过精心优化而开发，它具有下列特点：

1. 一站式，足够 50 次酶切-连接反应、40 次预扩反应和 1500 次 AFLP PCR（30 uL体系计算），但不包括 DNA 纯化和带型分析试剂（如 PAGE 电泳试剂和银染试剂）。

2. 本系列产品提供 EcoRI-MseI 组合，适用于 GC 含量在 50%以上的基因组。对GC 含量在 50%以下的基因组，需从本公司采购 AFLP 的 EcoRI-TaqI 组合。

3. 各种参数都经过优化，一次 PCR 所得 AFLP 片段数一般在 10-100 之间，可重复性好，误差小于 0.6%。

4. 本产品适用于基因组在 500 Mb-6000 Mb 的材料（如动物和植物）。对于基因组在 50-500 Mb 的材料（如细菌和真菌）或 50Mb 以下的材料（如质粒，cosmid，BAC，YAC 和 PAC 等），需要分别另购+0 型预扩增引物对+2 型扩增引物。

规格及成分 成 份 编 号 小扁盒包装
AFLP 酶切-连接 Buffer，10× LM100903a 100 uL（绿盖）
AFLP EcoRI-MseI 酶混合液 100903b 50 uL（红盖）
AFLP EcoRI-MseI 接头混合物 100903c 1000 uL（黄盖）
T4 DNA 连接酶 120411 50 uL（蓝盖）
PCR MagicMix 3.0 90805 5 mL×6（塑料袋）
+1 型 EcoRI-MseI 预扩增引物对 100903d 500 uL（白盖）
+3 型 EcoRI 引物（8 条） 100903e 十孔盒 1
+3 型 MseI 引物（8 条） 100903f 十孔盒 2
使用手册 100903sc 1 份

运输及保存 低温运输、-20℃保存, 有效期一年。

自备试剂 超纯水、Southern 级 DNA 纯化试剂，尿素-PAGE 电泳套装，银染试剂盒。

使用方法 

一、 DNA 提取（本试剂盒不提供相关试剂）用户需要自备 50-500ng Southern 级别的基因组 DNA，DNA 酶切彻底是 AFLP 的关键，所以好预实验以确保 DNA 能够被 EcoRI 和 MseI 内切酶彻底切开。

二、 限制性酶切和接头连接反应（本试剂盒足够 50 次 20uL 体系的酶切-连接反应）

1. 在 0.2 mL 离心管中设置 20 uL 的限制性内切酶酶切体系：

成分 用量

AFLP 酶切-连接 Buffer，10× 2 uL

样品 DNA

50 ng（对小基因组材料）

500 ng（对大基因组材料）

AFLP EcoR I-Mse I 酶混合液 1 uL

自备超纯水 加水到 20 uL

2. 轻柔混匀并短暂离心后，37℃保温 2 小时酶切（若 PCR 仪器不带热盖，则必须加 50uL自备石蜡油，否则水分会蒸发影响反应。下同）。反应结束后 70℃保温 15 分钟灭活酶。

3. 在体系中加入 20 uL EcoRI-MseI 接头混合物和 1 uL T4 DNA 连接酶，轻柔混匀并短暂离心，20℃保温 2-3 小时让接头跟酶切 DNA 片段相连。

4. 反应结束后在 40uL 的连接反应体系中加入自备 360uL超纯水，得到连接液10 倍稀释液，直接作为模板用于下步的预扩增或放-20℃保存待用。

三、 预扩增（本试剂盒足够 40 次 30uL 体系的预扩增反应）

5. 在 0.2 mL 离心管中设置 30 uL 的预扩 PCR 体系：成分 体积

连接液 10 倍稀释液（来于第 4 步） 5 uL

+1 型 EcoRI-MseI 预扩增引物对 10 uL

PCR MagicMix 3.0 15 uL

20180925dx

6. 离心数秒，按下列参数进行 PCR 预扩增（注意：一步是预合成，跟常规 PCR 不同）：预合成 72℃ 2 分钟，PCR 循环 20 次（94℃30S，56℃60S，72℃60S）

7. 取 10 uL PCR 产物在 1.5%琼脂糖胶上电泳检测，产物应为大小在 100-1500 bp 的模糊条带。本试剂盒的 PCR mix 含上样液和示踪染料，故不需要额外加 Loading Buffer。示踪染料的泳动速度相当于 50bp 的 DNA 片段。

8. 在剩下的 20uL 预扩增反应液中加入 980uL 自备超纯水，相当于稀释 50 倍，所得 50 倍PCR 稀释液，直接作为模板用于下步扩增或放-20℃保存待用。

四、选择性 PCR 扩增9. 制备引物：在十孔盒 1 和十孔盒 2 的共 16 管引物干粉中分别加入 1100uL 自备超纯水，震荡混匀得 16 管引物母液。每管取 66uL 引物母液与 1034uL 超纯水在 1.5mL 离心管中混合得 1100uL 此引物的工作液，共 16 管引物工作液。

10. 在 0.2 mL PCR 管中，加入下列成分（一次 PCR 时需要测试所有 8×8=64 种引物组合，需设置 64 个 PCR 反应。若已经知道哪个一种或几种引物组合适合，则可以直接使用

选中的引物），下面以一种 3 型 EcoR I 引物和+3 型 Mse I 引物组合为例：

成分 体积

50 倍 PCR 稀释液 5 uL

AFLP+3 型 EcoR I 引物工作液（八种之一） 5 uL

AFLP+3 型 Mse I 引物工作液（八种之一） 5 uL

PCR MagicMix 3.0 15 uL

11. 轻柔混匀后离心数秒，按下列参数进行 PCR：

温度 时间

PCR（13 次）

94℃ 30 秒

65℃ 30 秒（每次循环递减 0.7℃）

72℃ 60 秒

PCR（23 次）

94℃ 30 秒

55℃ 30 秒

72℃ 60 秒

延伸 72℃ 5 分钟

四、 尿素-PAGE 电泳和银染（需另购试剂并按相关手册进行）

12. PCR 结束后进行尿素-PAGE 电泳和银染分析。