LAP试剂盒；土壤亮氨酸氨基肽酶（LAP）ELISA试剂盒

LAP试剂盒；土壤亮氨酸氨基肽酶（LAP）ELISA试剂盒

使用目的：

适用于检测人动植物组织匀浆、细胞上清、血清、血浆、尿液或其他相关生物液体中浓度。

LAP试剂盒；土壤亮氨酸氨基肽酶（LAP）ELISA试剂盒检测原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被抗体的微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

LAP试剂盒；土壤亮氨酸氨基肽酶（LAP）ELISA试剂盒规格及配置：

  自备物品：

①.酶标仪（450nm）

②.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

③.37℃恒温箱

LAP试剂盒；土壤亮氨酸氨基肽酶（LAP）ELISA试剂盒样本的收集：

液体样本的收集：

1、血清：用无菌管收集，室温血液自然凝固 10-20 分钟，2-8℃条件离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分），仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2、血浆：应根据标本的要求选择 EDTA、肝素钠或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，2-8℃条件离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3、尿液：用无菌管收集，2-8℃条件离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

4、胸腹水：用无菌管收集，2-8℃条件离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5、脑脊液：用无菌管收集，2-8℃条件离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

6、唾液：用无菌管收集，2-8℃条件离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

7、细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。2-8℃条件离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

8、牛奶：用无菌管收集，2-8℃条件离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

9、蜂蜜：用无菌管收集，2-8℃条件离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

10、全血：用含有抗凝剂的无菌管收集，立即轻轻摇动，来回轻轻颠倒数次，使血液和抗凝剂混匀，以防血液凝固。

固体样本的收集 

1、组织标本：切割标本后，称取 1g 组织，加入 9ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分），仔细收集上清。分装一 份待检测，其余冷冻备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。对于植物组织，不好匀浆的话，就在液氮中充分研磨。

2、细胞内蛋白样本：许多待测蛋白不是分泌蛋白，而是存在于细胞内的蛋白，这个时候，要先收集细胞，洗涤干净，再破碎细胞，离心取上清。

（1）培养的细胞

A、动物细胞：用 PH7.2-7.4 的 PBS 稀释细胞悬液，使细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融（如果反复冻融，破碎效果不好，就采用超声波破碎），以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

B、植物细胞：用 PH7.2-7.4 的 PBS 稀释细胞悬液，使细胞浓度达到 100 万/ml 左右，置于冰盒上，用超声破碎仪，设置破碎 2s，冷却 30s 的方式，充分破碎细胞，以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

（2）组织的细胞

切割标本后，称取 1g 组织，加入 9ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。2-8℃条件离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分），去除上清，再用 pH7.2-7.4左右的 PBS 小心洗涤沉淀的细胞三遍。再用上述的细胞破碎方法破碎细胞。

3、细胞内蛋白样本：许多待测蛋白不是分泌蛋白，而是存在于细胞内的蛋白，这个时候，要先收集细胞，洗涤干净，再破碎细胞，离心取上清。

4、咽拭子：加入 2ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS，溶解咽拭子头部，摇匀，用镊子取出咽拭子并挤干液体，2-8℃条件离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分），仔细收集上清。分装一份待检测，其余冷冻备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。如果是测分泌蛋白，直接取上清检测，测试细胞内蛋白，要破碎细胞。

5、植物标本：取组织块（0.2g～0.5g）最少可到 5～10mg 在冰冷的 PBS 中漂洗，滤纸拭干，准确称重，放入 5ml 的匀浆管中；按重量(mg):体积(ml)=1:9 的比例加入 9 倍体积的匀浆介质于匀浆管中，冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块；匀浆的方式：手工匀浆，机器匀浆。 ① 手工匀浆：左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8 分钟），充分研碎，制成 20%的匀浆液。 ② 机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000 转/分 上下研磨制成 10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒，连续 3～5 次，在冰水中进行,可适当延长匀浆时间），镜检观察:取少量组织匀浆作涂片（直接涂片、染色均可以），显微镜下观察细胞是否破碎，若没有则可延长匀浆时间。将制备好的 10%匀浆液用普通离心机或低温低速离心机 4000 转/分左右,离心 10～15 分钟，取上清液进行测定。

LAP试剂盒；土壤亮氨酸氨基肽酶（LAP）ELISA试剂盒操作步骤：

①．从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

②．设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

③．样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

④．除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

⑤．弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次   （也可用洗板机洗板）。

⑥．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

⑦．每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。