方案摘要
方案下载应用领域 | 医疗/卫生 |
检测样本 | 骨骼 |
检测项目 | |
参考标准 | / |
与传统的2D 细胞培养技术相比,3D 细胞球体提供了更多的仿生微环境, 在许多组织工程应用中已被证明是有价值的。尽管3D 细胞培养具有受益 效应,但目前球体形成方法的可扩展性有限,对球体组织工程的临床翻译 提出了挑战。虽然最近采用的液滴微流体可以提供一个连续的生产过程, 但使用油和表面活性剂,通常低通量,以及额外的生物制造步骤的要求阻 碍了球体培养的临床翻译。在这里,使用清洁(例如,无油和无表面活性 剂) ,超高通量(例如,8.5 mL min-1,10000个球体 s-1) ,单步空气微流控 生物制造球体形成区室化水凝胶。这种新技术可以可靠地生产一维纤维, 二维平面和三维体积划分的水凝胶构造,其中每一个都允许空心球形成隔 室的明显(一)各向同性取向。在喷墨生物打印分区水凝胶中产生的球体在 成软骨行为方面优于2D 细胞培养物。此外,细胞球体可以从划分的水凝 胶中获得,并用于以自下而上的方式构建形状稳定的厘米大小的无生物材 料的活组织。因此,预计在空气中微流体生产的球形分区水凝胶可以促进 生产和使用的细胞球体的各种生物医学应用。
引言
2D 体外细胞培养历来是组织工程领域的 黄金标准,其目的是修复、再生或替换受 损的活组织。然而,传统的2D 细胞培养 环境不像它们在体内的天然对应物,因此 对细胞行为产生不利影响。3D 细胞培养 , 如细胞球体或类器官已经允许一种更加 仿生的方法来进行细胞培养。[6-8]已经广 泛报道,仿生3D 球体培养的细胞在用于 组织工程时优于2D 培养的细胞[9-13] ,并且可以促进更可靠的药物靶标发现,并 使得具有改进功能的宏观组织构建体的工 程。例如,载有干细胞球体的生物墨水的 3D 打印改善了生物制品构建体的功能行 为(例如,成软骨分化和软骨基质沉积) 。 虽然有希望,但是诸如球体培养等3D 培 养技术的生产方法阻碍了它们的临床翻译 , 这些生产方法通常是批处理过程,拥有 属性较低。
这些批量生产技术如微孔[9,10,12,21-24]和悬挂滴[13,2 5-27]需要多个复杂和耗时的步骤,只能提供有限的球体产量 。尽管特定的生物反应器方法可以提高产量,但它们仍然局 限于批处理过程,与微电池和悬挂液滴等隔离技术相比,这 些批处理过程通常对球体直径的控制水平较低。 [28]虽然这 可能足以进行小型实验室规模的实验,但仍然需要具有高生 产率和高单分散性的强大的单步生物制造技术来促进临床尺 寸组织的球体技术的临床翻译。 [29,30]微流体防火分区最近被研究用于将球体生产从批量生产过 程发展为连续生产过程。在中空生物材料隔室中的细胞微流 体封装允许细胞球形成微生物反应器的控制连续生产,这提 供了比传统的批处理工艺更高的生产率。 [31-3提供了比传统 的批处理工艺更高的生产率。 [31-39]
然而, 由于各种原因,传统的片上微流控液滴发生器的设计阻 碍了微流控液滴产生的球体在临床上的广泛应用。首先,传统 的芯片上微流体需要使用不可混溶的液体来形成液滴,这通常 需要使用已知具有潜在危害并且常常与临床应用不相容的油和 表面活性剂。因此,产生的球体形成隔室需要大量清洗, 以试 图在培养/使用之前除去油和表面活性剂,这与耗时的手工过 程有关,这对细胞活力有不利影响。[45,46]其次,虽然传统的 芯片上微流体允许连续的球体生产,但液滴形成通常仅限于滴 水状态,导致低吞吐量(< 10μLmin-1) ,这对于大多数临床应 用仍然不足。最后,从它们的隔室中回收球体以进行进一步的 生物制造加工通常需要一个复杂的多步骤过程,这可能对细胞 存活产生不利影响。因此,仍然需要一种清洁、快速、细胞友 好和单步生物制造策略,使大型工程组织具有原位球化形成特 性。
在这里,我们介绍了一种新的空气微流体(IAMF)[48]为基 础的生物打印技术,克服了球体使用的翻译限制。具体来说, IAMF 实现了包含无生物材料细胞的隔室的生物物质工程,这 些隔室起到了球体形成微反应器的作用。有利的是,这种创新 方法代表了用于以临床相关速率(1-8.5 mL min-1相当于10000 个球体 s-1)产生高密度细胞球体的临床尺寸水凝胶的工程的单 步生物制造技术。生产能力的显著提高是由于 IAMF 能够单分 散地赋予喷墨生物印刷油墨在喷射状态下具有中空隔室,而传 统的芯片上方法仅限于更慢的滴水状态。这种新型的生物制造 过程也是非常清洁的,因为 IAMF 消除了传统上对油,表面活 性剂或牺牲模板的需要, 以在工程组织内创建空心隔室。除了 传统的基于机器的喷墨生物打印之外,我们证明我们的内联自 下而上的生物制造也可以以简单的手持设备的形式使用, 以手 动打印具有多种复杂性的球体形成的分隔水凝胶,这进一步促 进了该技术与临床应用的兼容性。虽然微型组织的大规模生产 的翻译挑战对于过多的不同组织类型是重要的[28] ,但我们 产生了临床大小的软骨组织作为模型组织,同时承认使用这种 方法也可以产生广泛的其他(器官)形状。
结果和 讨 论
2.1. 空气微流体技术在分区水凝胶生物制备中的应用
IAMF 是一种微流体方法,通过在空气中将液体射流与由压电 驱动的液体射流产生的恒定周期的水滴流碰撞,使得能够以超 高吞吐量产生无芯片、无油和细胞相容的单分散微粒。 [48]
在这项研究中,我们将 IAMF 与喷墨生物打印相结合, 以允 许空气中形成的中空微胶囊的控制合并,从而能够生产大规模 的区室化水凝胶。为此,将两个微喷嘴设置与可移动的 XYZ收集工作台结合使用(图1a)。
为了形成中空微胶囊,含有氯化钙(CaCl 2)的核心微喷溶液 与通过使用压电驱动将振动叠加到微喷嘴上而产生的受控液滴 系统相撞(图1b)。具有降低表面张力(jcore > jalgate)的海藻酸 盐前体微喷的 Dropjet 聚结允许 Marangoni 驱动的封装(图1c) 。这种封装过程发生在 je something (iμD4/阝j2)1/3的时间尺 度上,i,D ,μ 和 j 分别表示微喷密度,直径,粘度和表面张 力,通常在几毫秒内。这使得在收集液滴之前的10-100毫秒的 液滴飞行时间内可以完全封装。这使得能够生产含有 CaCl2 核 心和海藻酸盐前体外壳的双层液滴。由此产生的核壳(即海藻 酸钙)化合物液滴通过从核心层向海藻酸盐层扩散的 CaCl2 以内 向外的方式交联(图1d)。由于离子海藻酸盐交联发生在毫秒范 围内[50] ,并且由于交联的内向外性质,当复合液滴仍然在空 气中时, 内部海藻酸盐层交联,而外部海藻酸盐层通过 Ca2 + 离子的内向扩散随时间发生交联。然后通过可移动的XYZ 收集器或微喷台以控制的方式收集部分交联的微胶囊。
值得注意的是,撞击的时刻是定时的,使得空气形成的微 囊的交联仍然在进行中,使得它们在着陆时立即与微囊进行物 理接触,从而有效地形成包含空心微隔室的瞬时固体3D 构建 体(图1e)。
我们假设通过使用标准的基于液滴的生物制造方法调整微 胶囊放置,可以以强大的,可预测的和可控的方式形成1D 纤 维,2D 平面和3D 体积的分区水凝胶(图1f)。使用手持生物打 印装置(图1g,h)证明了这种生物制造方法,其允许使用形状 稳定的区室化水凝胶手动直接填充缺陷(图1i-k)。该手持方法 预计将促进临床应用,如在外科手术过程中的原位生物打印。 此外,我们证明了这种新型的生物制造方法也可以与可编程3D生物打印机(图11,m)相结合,我们证明了允许生产由更复杂 的几何形状组成的大规模结构,如形状稳定的管状分区水凝胶 (图1n,o 和电影 S1,支持信息)。IAMF 的超高通量性质(高 达8.5 mL min-1)(图 S1,支持信息)允许以快速,直接和单步 方式生物制造临床尺寸的分区水凝胶(图1p,q)。
由于 IAMF 产生的液滴的超高吞吐量和短的空中飞行时间,通 常需要快速(毫秒)交联策略,如所提出的海藻酸盐离子交联或 光聚合。然而,依赖于较慢(几秒钟)交联机制的材料,如丝素 蛋白,仍然可以利用海藻酸钠作为牺牲结构互穿网络模板。
图 1. 高度分隔水凝胶的空气微流体生物制造。 ,a )使用空气微流体方法中的两个喷嘴的分区水凝胶生产过程的示意图。 ,b) 空气中液滴形成 和液滴/隔室封装的显微照片。 ,c) 表面张力马兰戈尼流能够通过水凝胶前体溶液封装核心液滴。 ,d) CaCl2从两层全水液滴内部向藻酸盐层扩 散,实现由内而外的离子交联机制,导致在两个液滴层之间的界面处交联藻酸盐,而壳中的交联仍然存在,正在进行中。 ,e) 利用微室外壳在受 到冲击时的持续交联来设计固体多室水凝胶。 ,f) 隔室的受控沉积允许 1D 纤维、2D 平面和 3D 体积的隔室水凝胶。 ,g) 示意图和 h) 具有集 成空气微流体装置的 3D 打印机的照片。 ,i) 使用 3D 打印机打印的空心管状分隔水凝胶结构的照片,j) 通过包含葡聚糖-FITC(绿色)和葡聚 糖-TRITC(红色)染色溶液观察到不渗漏。 ,k) 用于对隔室水凝胶生物墨水进行手动喷墨生物打印的手持式IAMF设备示意图。 ,l) 用于直接填 充塑料模具缺陷的手持式 IAMF 设备的照片。,通过手持式喷墨生物打印,模具 m) 之前和 n) 之后的荧光照片,o) 被证明形状稳定,即使从模具中取出后,也被证明形状稳定。 ,p) 以 8.5 mL min-1 的生产率生产的隔室荧光水凝胶的照片,能够在 35 秒内填充1.5× 1.5× 1.5 cmmmold 。 ,q)共焦荧光显微镜证实了隔室化水凝胶的形成,其中藻酸盐用葡聚糖-FITC染成绿色, 中空核心用葡聚糖-TRITC染成红色。
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微调动态交联以增强透明质酸水凝胶的3D生物打印能力
基于负载左氧氟沙星的两亲壳聚糖衍生物的 3D 打印水凝胶在伤口愈合中的应用
通过整合体外和计算机实验预测和阐明3D打印癌症细胞在水凝胶结构中的打印后行为-INKREDIBLE+
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