方案摘要
方案下载应用领域 | 生物产业 |
检测样本 | 其他 |
检测项目 | |
参考标准 | wu |
Q Exactive HF, DDA,DIA,293T,定量蛋白质组学 数据非依赖性的扫描模式(data-independent acquisition, DIA)是近几年来发展的一种新的质谱数据采集方式(1)。DIA 扫描模式中,超高分辨质谱对特定质量范围内的所有母离子进行碎裂,采集所有母离子的碎片离子,并快速地依次扫描相邻的母离子窗口内的所有碎片离子。DIA 的数据中包含了所有碎片离子的保留时间和强度信息。用非常小的质量偏差窗口(如 10 ppm)目标性地抽提同一肽段的多个子离子,计算子离子的强度,就能对该肽段进行鉴定和定量。 DIA 定量相比传统的基于母离子强度的 DDA 定量有选择性好,定量准确等优点,所以 DIA 成为定量蛋白组学新的热门发展方向 (2)。 Q Exactive HF 是赛默飞世尔科技在 2014 年的 ASMS 上推出的全新静电场轨道阱超高分辨质谱仪(3, 4)。Q Exactive HF 采用了分段式四极杆技术(Advanced Quadrupole Technology,AQT)使离子传输效率至少提高了 2 倍;超高场 Orbitrap 技术,提高了 Orbitrap 扫描速度,在 15000 分辨率时,二级谱图的扫描速度是 18 Hz。这两项技术提高了 Q Exactive HF 进行 DDA、DIA 数据的采集能力。本文用 Q Exactive HF 质谱,170 min 色谱梯度对 293T 细胞蛋白质组进行 DIA 定量分析,考察 Q Exacive HF DIA 定量的能力。
实验材料和方法
293T 细胞裂解液酶切肽段,样品中加入 iRT 肽段用于保留时间校正,DDA 和 DIA 数据采集,每种采集模式平行进行三次技术重复,DDA 用于构建谱图库,DIA 用于定量分析。
相同的 293T 样品用于 170 min 色谱梯度的 DIA 数据采集,并且平行进行 3 次技术重复,考察 DIA 的定量能力和CV。图 1 是 3 次 DIA 实验的 Base peak 图,保留时间和响应均一致,显示出较好的色谱稳定性。较好的色谱稳定性是获得可信非标记定量结果的前提。
3 次 DIA 实验分别能够抽提到 77,695 个肽段,6,028 个蛋白;77,673 个肽段,6,042 个蛋白;77,556 个肽段, 6,019 个蛋白(表 1)。DIA 能够鉴定到谱图库中 88% 的肽段,96.7% 的蛋白,显示 DIA 具有较高的分析通量。三次 DIA 实验肽段的 median CV 7.5%,蛋白的 median CV 4.3%,显示出 DIA 具有非常好的重现性以及定量的准确性。DIA 提峰的质量精度在经过校正后能够达到 3 ppm, 显示 Orbitrap 具有较高的质量精度。DIA 数据处理的方法就是对目标肽段的碎片离子进行色谱峰抽提,Orbitrap 能将质量抽提窗口缩小到 3 ppm,那么基于 Oribtrap 的 DIA 就能获得较好的选择性(图 2)。
TPA(Total Protein Amount)方法可以进行每个蛋白丰度的估计(5), 假设总的上样量是 1 µg。通过计算,丰度最高的蛋白是 Histone H2B type 1-L,柱上绝对浓度是 4631 pmol。丰度最低的蛋白是 Sister Chromatid cohesion protein DCC1,柱上绝对浓度是 6 fmol。丰度最低和丰度最高的蛋白相差 5 个数量级,显示 Orbitrap 具有非常宽的动态范围。
1. DDA 鉴定结果以及谱图库建立
取 293T 细胞裂解液酶切肽段约 1 µg 进行 170 min 色谱梯度的 DDA 数据采集,为了获得较全面的谱图库,DDA 实验平行进行三次技术重复。3 组 DDA 数据用 Proteome Discoverer 2.1 进行数据检索,控制 peptide FDR<0.01, protein FDR < 0.01,一共鉴定到 90,202 个肽段,6496 个蛋白,平均一个蛋白鉴定到 15 个肽段,显示 Q Exactive HF 进行蛋白鉴定实验能获得较好的蛋白序列覆盖率。
将 Proteme Discoverer 2.1 检索生成的 pdresult 文件导入Spectronaut 建立谱图库,该谱图库格式是 kit 文件,用于Spectronaut DIA 峰抽提。在建立谱图库时,筛选每个肽段至少包含 3 个碎片离子,最多包含 6 个碎片离子,碎片离子的m/z 300-1800。谱图库中一共含有 656,678 个碎片离子,87,743 个肽段,6,270 个蛋白。
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