方案摘要
方案下载| 应用领域 | 生物产业 |
| 检测样本 | 其他 |
| 检测项目 | |
| 参考标准 | wu |
Q Exactive HF， DDA，DIA，293T，定量蛋白质组学 数据非依赖性的扫描模式（data-independent acquisition， DIA）是近几年来发展的一种新的质谱数据采集方式(1)。DIA 扫描模式中，超高分辨质谱对特定质量范围内的所有母离子进行碎裂，采集所有母离子的碎片离子，并快速地依次扫描相邻的母离子窗口内的所有碎片离子。DIA 的数据中包含了所有碎片离子的保留时间和强度信息。用非常小的质量偏差窗口（如 10 ppm）目标性地抽提同一肽段的多个子离子，计算子离子的强度，就能对该肽段进行鉴定和定量。 DIA 定量相比传统的基于母离子强度的 DDA 定量有选择性好，定量准确等优点，所以 DIA 成为定量蛋白组学新的热门发展方向 (2)。 Q Exactive HF 是赛默飞世尔科技在 2014 年的 ASMS 上推出的全新静电场轨道阱超高分辨质谱仪(3, 4)。Q Exactive HF 采用了分段式四极杆技术（Advanced Quadrupole Technology，AQT）使离子传输效率至少提高了 2 倍；超高场 Orbitrap 技术，提高了 Orbitrap 扫描速度，在 15000 分辨率时，二级谱图的扫描速度是 18 Hz。这两项技术提高了 Q Exactive HF 进行 DDA、DIA 数据的采集能力。本文用 Q Exactive HF 质谱，170 min 色谱梯度对 293T 细胞蛋白质组进行 DIA 定量分析，考察 Q Exacive HF DIA 定量的能力。
实验材料和方法
293T 细胞裂解液酶切肽段，样品中加入 iRT 肽段用于保留时间校正，DDA 和 DIA 数据采集，每种采集模式平行进行三次技术重复，DDA 用于构建谱图库，DIA 用于定量分析。
相同的 293T 样品用于 170 min 色谱梯度的 DIA 数据采集，并且平行进行 3 次技术重复，考察 DIA 的定量能力和CV。图 1 是 3 次 DIA 实验的 Base peak 图，保留时间和响应均一致，显示出较好的色谱稳定性。较好的色谱稳定性是获得可信非标记定量结果的前提。
3 次 DIA 实验分别能够抽提到 77,695 个肽段，6,028 个蛋白；77,673 个肽段，6,042 个蛋白；77,556 个肽段， 6,019 个蛋白（表 1）。DIA 能够鉴定到谱图库中 88% 的肽段，96.7% 的蛋白，显示 DIA 具有较高的分析通量。三次 DIA 实验肽段的 median CV 7.5%，蛋白的 median CV 4.3%，显示出 DIA 具有非常好的重现性以及定量的准确性。DIA 提峰的质量精度在经过校正后能够达到 3 ppm， 显示 Orbitrap 具有较高的质量精度。DIA 数据处理的方法就是对目标肽段的碎片离子进行色谱峰抽提，Orbitrap 能将质量抽提窗口缩小到 3 ppm，那么基于 Oribtrap 的 DIA 就能获得较好的选择性（图 2）。
TPA（Total Protein Amount）方法可以进行每个蛋白丰度的估计（5）， 假设总的上样量是 1 µg。通过计算，丰度最高的蛋白是 Histone H2B type 1-L，柱上绝对浓度是 4631 pmol。丰度最低的蛋白是 Sister Chromatid cohesion protein DCC1，柱上绝对浓度是 6 fmol。丰度最低和丰度最高的蛋白相差 5 个数量级，显示 Orbitrap 具有非常宽的动态范围。
1. DDA 鉴定结果以及谱图库建立
取 293T 细胞裂解液酶切肽段约 1 µg 进行 170 min 色谱梯度的 DDA 数据采集，为了获得较全面的谱图库，DDA 实验平行进行三次技术重复。3 组 DDA 数据用 Proteome Discoverer 2.1 进行数据检索，控制 peptide FDR<0.01， protein FDR < 0.01，一共鉴定到 90,202 个肽段，6496 个蛋白，平均一个蛋白鉴定到 15 个肽段，显示 Q Exactive HF 进行蛋白鉴定实验能获得较好的蛋白序列覆盖率。
将 Proteme Discoverer 2.1 检索生成的 pdresult 文件导入Spectronaut 建立谱图库，该谱图库格式是 kit 文件，用于Spectronaut DIA 峰抽提。在建立谱图库时，筛选每个肽段至少包含 3 个碎片离子，最多包含 6 个碎片离子，碎片离子的m/z 300-1800。谱图库中一共含有 656,678 个碎片离子，87,743 个肽段，6,270 个蛋白。
文献贡献者
谱质分析--2020 版《中国药典》色谱与质谱解决方案
生物样品中糖基化分析检测方案
氨基酸及其衍生物代谢相关物质分析
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