研究背景
NF-кB属于转录因子蛋白复合物家族，在调节哺乳动物细胞的许多关键性过程中起到核心作用，包括增殖、凋亡、炎症、免疫和应激反应等。一旦免疫调节失衡，可能导致癌症、病毒感染、自身免疫性疾病等的发生。NF-кB结合其抑制蛋白IкBα，在细胞质中保持无活性状态。胞外信号激活细胞后，IкBα成为泛素化的目标，引起IкBα从NF-кB上脱落，进而促进NF-кB转位到细胞核中1。针对NF-кB转位过程的生化检测手段Western Blot，属于半定量的方法，无法提供每个细胞转位的结果。荧光显微镜可以在单细胞的基础上对核转位进行图像识别，但通量低，很难获得客观的具有统计学意义的数据。
NF-кB活化信号通路2
案例赏析
接下来分享的方案中使用了配置物镜组的Cytek® Amnis® ImageStream®X Mk II 成像流式细胞仪，这一平台将流式细胞术的高通量分析能力与显微镜提供的空间信息完美的结合在一起。选择配套的Cytek®IDEAS® 图像分析软件中的Nuclear Localization Wizard核转位定量分析模块，使用Similarity参数，将NF-кB和细胞核各自的图像通道逐像素地进行关联，实现图像数据定量分析。该向导分析了每一个细胞的7AAD标记细胞核图像与Alexa Fluor®488标记NF-кB图像的相似程度，并进行评分，相似度评分高，意味着核转位程度越高。前3个案例均采用Amnis® NF-кB试剂盒（Part No. ACS10000），包含了 Alexa Fluor® 488 偶联的抗人 NF-кB 抗体、核染料 7AAD、固定破膜缓冲液，对不同来源的细胞中的NF-кB 转位程度进行精准定量。
案例 1
定量分析THP-1细胞中NF-кB转位
用 1 μg/mL 脂多糖 （LPS） 刺激活化 THP-1 人单核细胞白血病细胞的NF-κB通路，在40x或60x的放大倍数下，每个样品采集10,000-50,000个细胞图像。图中显示了对照组（蓝色曲线）和1 μg/mL LPS刺激后（红色曲线）THP-1细胞的相似性评分的统计直方图，评分越高，代表核转位程度越高，同时能够呈现每个细胞NF-κB（绿色）和7AAD（红色）的叠加图像。
对照组（蓝色曲线）和LPS刺激后（红色曲线）
THP-1细胞中NF-кB转位
案例 2
量化分析单核细胞和嗜酸性粒细胞中的
NF-кB转位
用10 μg/mL LPS刺激外周血1小时诱导NF-кB转位。LPS刺激单核细胞后，会激活包括NF-кB通路在内的多种胞内信号通路，而嗜酸性粒细胞则对LPS没有反应。通过CD14标记人单核细胞，利用CD45的表达和SSC信号区分嗜酸性粒细胞。对照组（蓝色曲线）和LPS刺激组（红色曲线）的单核细胞及嗜酸性粒细胞相似性评分的直方图显示, CD14+单核细胞的平均相似度评分在LPS刺激前后有明显变化，而LPS刺激的嗜酸性粒细胞平均相似度评分则没有显著变化。
单核细胞及嗜酸性粒细胞的相似性评分直方图
及代表性细胞图像
案例 3
剂量依赖性TNF-α诱导HL-60细胞的
NF-кB转位
用 0-10 ng/mL 肿瘤坏死因子（TNF-α）刺激HL-60 人早幼粒白血病细胞30分钟，随着TNF-α剂量的增加，平均相似性评分也随之增加，2.5ng/mL TNF-α 剂量时达到最大平均相似性评分，表明HL-60细胞的NF-кB转位存在TNF-α剂量依赖性。
TNF-α诱导后HL-60细胞的相似性评分直方图
及代表性细胞图像
案例 4
APCs结合T细胞诱导NF-κB发生转位
实验中的抗原呈递细胞（APCs）选择了葡萄球菌肠毒素B（SEB）刺激的Raji B细胞。APCs与从外周血中纯化的人T细胞孵育，再将细胞固定破膜，并用CD3-PE-TexasRed（T细胞，橙色），CD19-PE（Raji B细胞，黄色），NF-κB-FITC（绿色），DAPI（细胞核，粉色）分别进行标记。配置60X物镜的Cytek® Amnis® ImageStream®X Mk II成像流式细胞仪，能够精准定位到T细胞- APCs偶连体，其中T细胞的中位数相似性评分为0.98；未结合APCs的单个T细胞的中位数相似性评分为0.29。这表明APCs的结合激活了T细胞，诱导NF-κB发生转位。
单个T细胞（蓝色曲线）和结合APCs的T细胞（红色曲线）的
相似性评分及图像
总结展望
免疫细胞亚群众多，免疫信号通路纷繁复杂，研究人员要定位到感兴趣细胞的某一通路靶点，难度就好比大海捞针。Cytek® Amnis® ImageStream®X Mk II成像流式细胞仪 结合了对大量样本的定量分析能力以及荧光显微镜的图像信息，可以从复杂生物样品中精准表征每个目的细胞，以客观的统计学方式监测细胞亚群的免疫调控过程。量化成像流式细胞仪洞见细胞更高维度，挖掘图像更深细节，流式图像信息交互，定义技术应用的新标准。
Cytek® Amnis® ImageStream®X Mk II成像流式细胞仪
参考文献
1Maguire, O., Collins, C., O'Loughlin, K., Miecznikowski, J. & Minderman, H. Quantifying nuclear p65 as a parameter for NF-κB activation: Correlation between ImageStream cytometry, microscopy, and Western blot. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology 79, 461-469, doi:10.1002/cyto.a.21068 (2011).
2Liu, T., Zhang, L., Joo, D. & Sun, S.-C. NF-κB signaling in inflammation. Signal Transduct Target Ther 2, 17023-17023, doi:10.1038/sigtrans.2017.23 (2017).
关于Cytek
About Cytek /
Cytek Biosciences, Inc.（Nasdaq: CTKB）作为一家全球技术领先的生命科学技术公司，通过其受专利保护的全光谱分析（Full Spectrum Profiling™，FSP™）技术，提供高分辨率、高参数和高灵敏度的新一代细胞分析工具。Cytek的创新技术通过检测荧光信号的完整光谱信息，以实现更高水平更高灵敏度的多参数检测。Cytek的FSP™平台包括其核心仪器 ——Aurora和Northern Lights™分析系统、Aurora CS分选系统，Amnis®和Guava®品牌下的流式细胞仪和成像产品，以及试剂、软件和服务，为客户提供全面和完整的解决方案。Cytek总部位于美国加利福尼亚州Fremont，在全球设有分部和分销渠道。
更多的相关信息，请登录Cytek的官方网站：www.cytekbio.com和www.cytekbio.com.cn。
注：Cytek®, Tonbo Biosciences, cFluor®, Full Spectrum Profiling™, FSP™和Northern Lights™是Cytek Biosciences, Inc. 的商标或注册商标。Cytek®全光谱检测技术相关专利包括但不限于：US10739245B2，US11169076B2，US10788411B2。
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