I. 目的
本实验方案的目的是描述如何在1 / 4体积反应中,使用MANTIS在96孔板上制备和组合试剂,以构建高通量SMART-Seq v4 cDNA文库。
II. 注意事项
下面指定的试剂体积是使用SMART-Seq v4 Ultra低输入RNA试剂盒按照本方案进行测序时精确计算得出的,该试剂盒用于测序,可在三块孔板上进行96次反应,每块板四分之一体积试剂,使用单一的96反应试剂盒(634891。为了确保试剂有足够的数量进行3x96个1/4体积反应,请务必遵守LV、HV芯片的灌注和预分配体积:
LV芯片灌注体积= 5.4 μl
LV芯片预分配体积为=1.2 μl
HV芯片灌注体积=12 μl
HV芯片预分配体积=5 μl
每一个新的添加物使用一个新的芯片。在一天运行结束后,按照相应的洗涤步骤清洗所有LV和HV芯片。
注意避免在整个过程中出现气泡。
有关SMART-Seq v4 Ultra低输入RNA试剂盒测序的更多信息,请参考试剂盒用户手册,可在takarabio. com/manuals获得。
III. 实验方案
A.反应缓冲液的制备
1. 使用1.5 ml微量离心管,手动分配31μl的10X裂解液。加入RNAse抑制剂1.6μl,核酸酶游离水46.5μl。然后用旋涡轻轻混合,快速旋转试剂。
B. 样品的制备
1.在不含Mg2 +和Ca2 +离子的PBS中洗涤细胞,然后将细胞分配或分选到96-孔板的各个孔中,使每个细胞悬浮于2μl不含Ca2 + / Mg2 +的PBS中(更小的悬浮体积也在接受范围内,参阅步骤3)。
2.在200ul移液器吸头中装入72.75ul反应缓冲液,然后将吸头装到LV Mantis芯片上(位置1)。对MANTIS进行编程,以从所选位置添加0.6 µl反应缓冲液。
3.可选:如果步骤1中每个单细胞悬浮液的体积小于2 ul,则用200μl无核酸酶水填充200μl移液器吸头,并将吸头装到Mantis LV芯片上(位置6)。对MANTIS进行编程,以从选定位置添加足够量的无核酸酶水,以使每个孔的总流体量达到2 µl。对于阴性对照样品,在空的孔中加入2µl无核酸酶的水。
4.在200ul 移液器吸头中装入60ul 3'SMART CDS Primer IIA,然后装到LV Mantis芯片上(位置2)。对MANTIS进行编程,以从所选位置添加0.5µl 3'SMART CDS Primer IIA(12µM)。
5. 用封口胶带密封孔板,收集试剂,轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60秒。
C.低聚糖退火
1.将孔板从B部分转移到预热的热循环器中,并在72度下孵育3分钟。
2. 孵化3分钟后,放置到冰块上2分钟。
3. 当孔板放在冰上时,准备RT反应混合液(下方D部分)。
D.RT反应混合液的制备
1. 将下列试剂按如下顺序室温添加到1.5 ml无核酸酶管中,务必在使用前最后添加SMARTScribe™II逆转录酶。上下轻轻混合。为了生成足够96次反应的主混合物,使用多10%体积的试剂,以及10uL灌注体积 进行溢出反应。
2.在2,000µl的移液管吸头中加入208 ul的RT反应混合液,装到LV MANTIS芯片上(位置3)。用MANTIS液处理器编程,将1.9µl的RT反应混合液加入到选择的孔中。
3. 用封口胶带密封孔板,收集试剂,轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60秒。
E.第一链的合成
1. 将孔板从D部分转移到一个预热的热循环器中,并运行以下程序 :
F.PCR扩增cDNA
1.将下列试剂在1.5uL管中冰上混合。务必在使用前最后添加SeqAmp™DNA聚合酶。上下吹打轻轻混合。上下轻轻混合。为了生成足够96次反应的主混合物,使用足够进行12个溢出反应的试剂量(即总共108个反应)。
2.在1,000 ul的移液管吸头中加入810 ul的RT反应混合液,装到MANTIS芯片上(位置3)。用MANTIS液处理器编程,将7.5 µl的RT反应混合液从选择的位置加入到96孔中。
3. 用封口胶带密封孔板,收集试剂,轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60秒。
4. 将孔板转移到预热的热循环器中,然后运行以下程序:
*使用以下表格作为指导,以帮助确定输入的最佳PCR循环次数:
5. PCR反应完成后,在200µl移液管吸头中加入60µl的10X裂解缓冲液,并将吸头装到LV Mantis芯片上(位置1)。用MANTIS液处理器编程,将0.3 μl的10X裂解缓冲液加入到选择的孔中。
6.如下一阶段(阶段G)所示,可以使用SPRI beads磁珠手工纯化cDNA。
G.用Agencourt AMPure XP试剂盒纯化扩增的cDNA
1. 每次使用前,取磁珠等分液置于室温下至少30分钟,搅拌均匀即可。
2. 每次实验准备新鲜的80%乙醇。每个样品需要100 μl。
3. 需要一个能容纳96孔板的磁力分离架。
4. 旋转AMPure XP磁珠混合均匀,然后在每个样品中加13 μl。
5. 通过轻轻旋转或上下摇晃移液至少10次,彻底混合。
6. 室温孵化8分钟,让cDNA与磁珠结合。
7. 轻轻地旋转样品,从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约5分钟或更长时间,直至液体完全清澈,上清液中无磁珠残留。
8. 当样品放在磁力分离架上时,用移液管移去上清液并丢弃。
9.把样品放在磁力分离架上。每个样品添加50μl新鲜配制的80%乙醇,不干扰磁珠。等待30秒后,小心移去含有污染物的上清液。在清洗过程中, cDNA将继续结合在磁珠上。
10. 重复乙醇清洗(步骤9)一次。
11. 轻轻地旋转样品,从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上30秒,然后用吸管除去所有剩余的乙醇。
12. 在室温下放置样品约2-2.5分钟,直到颗粒不再有光泽,但在裂纹出现之前。
13. 待磁珠干燥后,加17μl的洗脱缓冲液盖住磁珠。从磁力分离架中取出样品,彻底混合,重新悬浮磁珠。
14. 室温孵化2分钟以补水。
15. 轻地旋转样品,从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约1分钟或更长时间,直至液体完全清澈。
16. 含有纯化cDNA的上清液从每个孔转移到无核酸酶,低粘附力的管中。在每个试管上贴上样品信息标签,并在-20°C保存。
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