I. 介绍
本实验步骤描述了如何在MANTIS®液体处理器上使用SMART-Seq单细胞试剂盒(SSsc Kit, Cat)在96-孔板 上从单个细胞中生成cDNA (SSsc kit, Cat. # 634472)。
II. 概论
一个96-反应试剂盒提供了足够的试剂来执行这个实验方案。为了确保试剂有足够的数量进行96个全体 积反应,请务必遵守LV、HV芯片的灌注和预分配体积:
LV芯片灌注体积= 5.4 μl
LV芯片预分配体积为=1.2 μl
HV芯片灌注体积=12 μl
HV芯片预分配体积=5 μl
每一个新的添加物使用一个新的芯片。在一天运行结束后,按照相应的洗涤步骤清洗所有LV和HV芯片。
注意避免在整个过程中出现气泡。
有关SMART-Seq单细胞套件的更多信息,请参阅SMART-Seq单细胞套件用户手册。
III. 实验步骤
A. 用于细胞分选的96孔板的制备
1. 为了制作CDS分选溶液(CSS),首先手动注入114μl 10X裂解缓冲液到1.5 ml无核酸酶管中。
2. 添加6μl核糖核酸酶抑制剂(40 U /μl),通过缓慢混合后快速旋转试剂。
3. 加入120μl的3’SMART-Seq CDS Primer II A
4. 加1,260μl无核酸酶水(总体积1,500μl)。
5. 缓慢旋转混合物。
6. 将750μl的CSS注入两个1000μl的吸管剪短,并将尖端装入LVMANTIS芯片(位置1和2)。通过对 MANTIS液体处理器编写程序,从选择的位置添加3.2μl CSS到每个孔中。(每个孔将得到两份6.3 μl当量的CSS)
注:在本实验方案中,我们假设FACS对细胞的分选不会改变板孔中液体的体积。如果分选机分配了不可忽略体积的鞘液量,可通过减少无核酸酶水的量来调整CSS混合物的体积,使其总体积保持在12.6μl /孔。
安全停止点:孔板可在-20°C保存过夜。
B. 细胞分类
1. 将细胞直接注入含有CSS的板孔中。
2. 分类完成后,将孔板密封,并将其快速旋转,使细胞到达孔的底部。
3. 立即将孔板放置于干冰上约5分钟,然后转移到-80°C的冰箱。
安全停止点:孔板可在-80°C保存过夜。
C. 低聚糖退火
1. 从-80°C的冰箱中取出孔板,让它解冻约1分钟,并轻微旋转。然后,向下旋转孔板,收集孔底的 内容物。
2. 将孔板转移到预热过的热循环器中,在72°C孵化3分钟
3. 孵化3分钟后,放置到冰块上2分钟。
4. 当孔板放在冰上时,准备RT反应混合液(D部分)。
D. RT反应混合液的制备
1. 将下列试剂按如下顺序室温添加到1.5 ml无核酸酶管中,制备足够的RT反应混合物,进行96次 反应。务必在使用前最后添加SMARTScribe™II逆转录酶,上下轻轻混合。
*该图表详细说明了每种成分进行96次反应所需的量(相当于一孔板的量),包括以计算移液误差的补充体积。
2. 在1,000 μl的移液管顶端加入795μl的RT反应混合也,装入LV MANTIS 芯片上(位置3)。用MANTIS液体处理器编程,将7.5μl的RT反应混合液加入到选择的孔中。
3. 用封口胶带密封孔板,收集试剂,轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60 秒。
E. 第一链的合成
1. 将孔板从D部分转移到一个预热的热循环器中,并运行以下程序 :
2. 程序完成后,以每分钟2000转的速度旋转平板30-60秒。
安全停止点:孔板可在4°C保存过夜。
F. PCR扩增cDNA
1. 将以下试剂按照顺序加入到15 ml冰管中,准备足够的96个反应的PCR反应混合液。请务必在使 用前最后添加SeqAmp™DNA聚合酶,上下轻轻混合。
*该图表详细说明了每种成分进行96次反应所需的量(相当于一孔板的量),包括以计算移液误差的补充体积。
2. 在3个1000μl的移液管吸头加入1080μl PCR主混合液,将每个吸头装入HV MANTIS 芯片(位置 4-6)。每1000μl的移液器吸头,使用MANTIS液体处理器编程,在E阶段制备的孔板每孔中加入 10μl的PCR主混合液。
3. 用封口胶带密封孔板,收集试剂,轻轻旋转3-5次孔板。以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60 秒。
4. 将孔板转移到预热过的热循环器中,运行以下程序:
*使用以下表格作为指导,以帮助确定输入的最佳PCR循环次数:
5. 如下一阶段(阶段G)所示,可以使用Agencourt AMPure XP磁珠手工纯化cDNA。
安全停止点:孔板可在4°C保存过夜。
G. 用Agencourt AMPure XP试剂盒纯化扩增的cDNA
1. 每次使用前,取适量置于室温下至少30分钟,搅拌均匀即可。
2. 每次实验准备新鲜的80%乙醇。每个样品需要400μl。
3. 需要一个能容纳96孔板的磁力分离架。
4. 旋转AMPure XP磁珠混合均匀,然后在每个样品中加40μl。
5. 通过轻轻旋转或上下摇晃移液至少10次,彻底混合。
6. 室温孵化8分钟,让cDNA与磁珠结合。
7. 轻轻地旋转样品,从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约5分钟或更长时间,直 至液体完全清澈,上清液中无磁珠残留。
8. 当样品放在磁力分离架上时,用移液管移去上清液并丢弃。
9. 把样品放在磁力分离架上。每个样品添加50μl新鲜配制的80%乙醇,不干扰磁珠。等待30秒后, 小心移去含有污染物的上清液。在清洗过程中, cDNA将继续结合在磁珠上。
10. 重复乙醇清洗(步骤9)一次。
11. 轻轻地旋转样品,从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上30秒,然后用吸管除去所 有剩余的乙醇。
12. 在室温下放置样品约2-2.5分钟,直到颗粒不再有光泽,但在裂纹出现之前。
13. 待磁珠干燥后,加17μl的洗脱缓冲液盖住磁珠。从磁力分离架中取出样品,彻底混合,重新悬浮磁珠。
14. 室温孵化2分钟以补水。
15. 轻轻地旋转样品,从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约1分钟或更长时间,直 至液体完全清澈。
16. 含有纯化cDNA的上清液从每个孔转移到无核酸酶,低粘附力的管中。在每个试管上贴上样品信 息标签,并在-20°C保存,直到库准备好。
安全停止点:孔板可在-20°C保存过夜。
17. 参考SMART-Seq Single Cell Kit用户手册,了解量化和库准备选项。
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