用于单细胞质谱分析的SCoPE2样品制备

使用MANTIS®液体处理器，解决了处理单细胞样品特有的问题，提高了新工作流程的定量准确性

量化单个哺乳动物细胞中蛋白质历来依靠免疫抗体技术，如CyTOF、单细胞免疫印迹和邻近延伸试验。尽管有效，但这些方法在生产通量上受到限制，且它们的准确性可能由于缺乏高度特异性抗体而降低。此外，和任何用于研究细胞的免疫分析方法一样，这些技术都面临着与细胞通透性和表位可及性相关的挑战。

为了解决这些问题，东北大学斯拉沃夫实验室的研究人员最近开发了单细胞蛋白质组学质谱 (SCoPE-MS)，这是一种使用同位素标记定量 (TMT)标记单细胞多肽的技术。通过在纳米液相色谱分离之前将标记的肽与标记的载体肽混合， SCoPE-MS被证明可以极大地减少样品损失——当处理低丰度材料时如单细胞时，这是一个关键的考虑因素。对小鼠胚胎干细胞分化中的1000多种蛋白质进行定量分析，并将这些数据与mRNA表达进行比较，不仅为SCoPE-MS定 量表征单细胞基因调控奠定了基础，并且强调了它根据蛋白质组对细胞进行分类的潜力。

随着自动化和小型化样品制备的引入2，SCoPE-MS已经发展成为SCoPE2。除了提供更好的定量精度外，SCoPE 2有利于降低成本、减少操作时间，显著提高样品制备和测量的通量。MANTIS®液体处理器(图1)是这一成功的关键，提供了可靠的亚微升容量分配，甚至是出了名难分配的液体，如用于存储TMT的100%乙腈。

图1：MANTIS®液体处理器

单细胞样品处理的独特挑战

样本低通量是单细胞研究人员面临的主要问题。一个“正常”的哺乳动物细胞的蛋白质组通常 只有50-500pg，质量上限为广泛使用的HeLa细胞系，而像单核细胞这样的细胞含有较少的蛋白质。因此，进行一项实验需要将数十个、数百个甚至数千个样品结合起来，以获得足够的数量进行分析。反之，这给并行样本处理带来了挑战，必须确保将样本损失降到最低，以避免时间、资源的浪费。

综合处理这些问题的方法

斯拉沃夫实验室的研究人员已经确定了几种克服上述挑战的方法。为了解决低样品丰度的问题，设计了减少表面损失的措施，允许使用小体积样品。细胞裂解方法的改变省去了在质谱分析之前的清理步骤，这是现有质谱方法中的一个关键步骤，通常会损失大量的蛋白质。多孔板的使用有助于确保分析是可靠和稳健的。最后，自动化的引入是消除人工样本处理错误和增加通量的基础。

SCoPE2工作流程

为了解MANTIS®液体处理器是如何运用于SCoPE2中，掌握SCoPE2工作流程是很重要的(图2) 。下面展示的工作流总结，用橙色标出了使用MANTIS®液体处理器的阶段。

SCoPE2 工作流程：

• 用1 μL含25 pmol Waters MassPREPTM（一种简单的5肽混合物，有助于钝化塑料制品）的纯水制备384-孔板。

• 使用细胞分拣器将单个细胞分配到孔板中，以实现随机布局(图3)，并在-80°C冷冻孔板。

• 将孔板快速转到PCR机上，并在90°C加热10分钟溶解细胞。

• 慢速旋转孔板，冷却，在水浴声纳器孵育5分钟，然后再次旋转。

• 每孔加入0.2 μL主混合液（00mM TEAB, 10ng /μL胰蛋白酶，0.25单位/μL苯并酮酶），将蛋白分解为多肽，37℃孵化3小时。

• 每孔加入0.5 μL 22 mM TMT（100%乙腈）标记多肽，室温孵化1小时。

• 每孔加入0.2μL0.5％羟胺，淬灭任何未反应的TMT，室温孵化30分钟。

• 使用多道移液管组合样品，转移到自动进样器玻璃插入瓶中，集中干燥。

• 样品重新悬浮于1.2 μL 0.1%甲酸溶液中，用于LC-MS/MS分析。

图2：SSsc工作流。使用MANTIS®液体处理器进行的步骤以橙色显示。

使用MANTIS®液体处理器提高了定量准确性

通过在原有的SCoPE-MS工作流程中引入自动化、小型化的样品制备，斯拉沃夫实验室的研究人员获益于显著增加的实验通量。使用SCoPE2，可在短短10天的仪器运行时间内量化1018个单个单核细胞和巨噬细胞中超过2700个蛋白质，量化的蛋白质允许通过细胞类型识别单个细胞。

MANTIS®液体处理器是为SCoPE2工作流程四个关键步骤提供可靠的亚微升分配的重要组成部分，即为细胞分选板的准备、蛋白质分解、肽标记和TMT反应的猝灭。MANTIS®液体处理器的几个重要特性使SCoPE2选择了它，首先是它的单喷嘴结构和非接触式分配能力。由于每个孔包含不同的细胞类型（图3），必须避免交叉污染。

图3:在MANTIS®液体处理器上分配的随机布局示例：绿色-载体，蓝色-细胞1型，红色-细胞2型，黑色-控制（无细胞）。

MANTIS®液体处理器的理想特性是它与各种试剂的兼容性。虽然分配水溶液对大多数液体处理平台没有什么问题，但准确分配亚微升体积的困难液体，如100%乙腈（用于存储和稀释 TMT标签）是具有相当挑战性的。最后，通过高度直观的软件，可以方便且快捷地集成到现有的工作流程中，MANTIS®液体处理器使斯拉沃夫实验室的研究人员能够继续开发SCoPE2，不会因为仪器设置造成延误。