存在的问题:
完整膜蛋白结晶最佳条件的发现对于研究者而言非常耗时。晶体可能需要两周或更长时间才能形成,这使得优化结晶生长条件的过程极其漫长。
光漂白后的荧光恢复 (FRAP)
预筛选结晶条件以消除那些不利于结晶的条件。用户可以在短短 30 分钟内将这些条件缩小范围至一小部分利于结晶的条件。
如果蛋白质不能在脂质立方相中扩散,
那么它们就不可能形成晶体。
FRAP 系统可以检查蛋白质制剂,节省用户时间
为获得完整的膜蛋白,FRAP 在广泛不同的盐晶条件下对 96 孔板进行检测。在大多数条件下良好的光漂白荧光恢复意味值得用该样品进行 LCP 结晶。
FRAP 可以用来确定哪种蛋白质制剂最好
我们使用两种不同的去污剂对一个完整的膜蛋白进行纯化,因此在广泛的结晶条件下 FRAP 荧光恢复存在显著差异。这里 LDAO 被证明是一种更适合纯化的去污剂,应该用于结晶试验。如果在 SDS 中纯化的蛋白质几乎没有迁移率,那么它就不会结晶。
在 30 分钟内筛选 96 种结晶条件
FRAP 能够自动分析 96 孔 LCP 板以确定每个液滴的迁移率。每个孔都通过聚焦的激光点进行光漂白,并测量固定时间点后的荧光恢复。而在液滴中可迁移的蛋白质百分比表明是否可能发生结晶。
FRAP 成像仪发射光漂白激光脉冲,该脉冲从二向色镜反射,通过激发滤光片,再被第二个二向色镜反射,从而漂白样品。
LED 通过聚光镜照射光线,光线沿着与激光相同的路径,照亮样品。
接着处理荧光图像以确定表明蛋白质迁移率的光漂白点的恢复时间。
数据分析容易
系统提供的软件组用于跟踪和分析每个实验的得分。得分以颜色编码的概览显示,让用户一眼就能识别出结晶孔。用户可以在软件中对结晶孔进行标记,以备日后参考。在上面的例子中,H8 孔蛋白迁移率最高,最有可能生长晶体。D12 孔迁移率为零,最不可能生长晶体。
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