干货分享 | Western Blot 实验第一步 —— 样本制备的注意事项和裂解液选择

易孛特生命科学（上海）有限公司

2024/09/19 17:46

Western Blot 是分子生物学、生物化学、遗传免疫学等常用的蛋白质分析实验，主要是对某一样本或者混合物中的靶标蛋白进行定性和半定量分析。Western Blot 实验步骤多，耗时长，每一步稍有不慎便可能会导致最终结果出现异常，蛋白样本制备是Western Blot 实验的第一步，可谓是万丈高楼的地基，如果地基没打好，那么后续所有的操作都是白费。

1.裂解液的选择

组织和细胞中的蛋白需要经过裂解液裂解才能得到释放，但是不同的裂解液对于不同位置的蛋白提取能力不同，因此我们要根据蛋白质的定位选择合适的裂解液。下表是蛋白质位置及对应裂解缓冲液供大家参考：

蛋白质位置

推荐缓冲液

裂解缓冲液配方

全细胞

NP-40、

Triton X-100

或 RIPA

50 mM Tris；

150 mM NaCl；

1.0% NP-40

（或 Triton X-100 ）

细胞质

（可溶）

Tris-HCl

20 mM Tris-HCl，

pH 7.5

细胞骨架

蛋白

Tris-Triton

10 mM Tris，pH 7.4；

100 mM NaCl；

1 mM EDTA；

1 mM EGTA；

1% Triton X-100；

10% 甘油；

0.1% SDS；

0.5% 脱氧胆酸盐

细胞膜蛋白

RIPA 或细胞膜

蛋白抽提试剂盒

50 mM Tris；

150 mM NaCl；

1.0% NP-40 或

Triton X-100；

0.5% 脱氧胆酸钠；

0.1% SDS

细胞核蛋白

RIPA 或细胞核

蛋白分离试剂盒

根据试剂盒

说明书进行操作

线粒体蛋白

RIPA 或线粒体

分离试剂盒

根据试剂盒

说明书进行操作

一旦样品开始裂解，蛋白降解、去磷酸化和变性也随即开始，所以样本裂解过程中要全程保持低温（冰上或4℃），所使用的试剂和耗材要提前预冷，并且裂解前几分钟要向裂解缓冲液中加入合适的酶抑制剂来减缓这些反应。常用的蛋白酶抑制剂如下表，我们也可以根据需求自行配制或者选择商家优化的蛋白酶抑制剂混合物。

抑制剂	抑制蛋白酶 /磷酸酶类型	加入裂解液中的终浓度	储存液 (store at -20°C 或者 -80℃，不得多次反复冻融)
PMSF	丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶	1 mM	用乙醇、甲醇或者异丙醇稀释至 100 mM
AEBSF	丝氨酸蛋白酶抑制剂	2 mM	水或者DMSO 配制 10 mM
E-64 (Proteinase inhibitor E 64)	半胱氨酸蛋白酶	14 μM	DMSO配制，溶解度≥53.6mg/mL
抑肽酶 (Aprotinin )	丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶	2 μg/mL	用水配制至10 mg/mL
亮肽素 (Leupeptin )	丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸蛋白酶、溶酶体蛋白酶	5–10 μg/mL	用水配制，水中溶解度可以达到95 mg/mL
胃酶抑素A (Pepstatin A )	天冬氨酸蛋白酶	1 μg/mL	用甲醇稀释至1 mM
EDTA	金属蛋白酶	1-5 mM	用水配制至 0.1-0.5 M。 pH 调节至 8.0

如果目的蛋白涉及到磷酸化蛋白，除了加入蛋白酶抑制剂之外，还需要加入磷酸酶抑制剂，常用的磷酸酶抑制剂如下表，我们也可以根据需求自行配制或者选择商家优化的蛋白酶抑制剂混合物。

抑制剂

抑制蛋白酶/

磷酸酶类型

加入裂解

液中的终

浓度

储存液(store at -20°C或者-80℃，

不得多次反复冻融)

焦磷酸钠

（sodium pyrophosphate）

丝氨酸/

苏氨酸磷酸酶

1 mM

用水配制：溶解度可达(70mg/ml)

β-甘油磷酸

钠盐水合物

(β-glycerophos

phate)

丝氨酸/

苏氨酸磷酸酶

1 mM

用水配制：溶解度可达60-100mg/mL

氟化钠

(Sodium

fluoride)

丝氨酸/

苏氨酸磷酸酶、

酸性磷酸酶

5–10mM

用水配制 :≥ 50 mg/mL

(1190.76mM)

原钒酸钠

(Sodium ortho

vanadate)

碱性磷酸酶和

酪氨酸磷酸酶

1 mM

用水配制 :8.33 mg/mL

(45.29 mM)

2.样本制备的注意事项

① 裂解液缓冲液 pH 值要合适，太低或者太高都有可能会引起蛋白的变性、析出，一般采用接近生理 pH 的缓冲液，比如 Tris-HCl，PBS 等，缓冲能力强。

② 蛋白提取时尽量保证不同样品的盐浓度一致，盐离子浓度不一致会导致蛋白条带宽窄不一；同时裂解液的盐离子浓度不能太高，一般也是采用接近生理状态的盐离子浓度，防止蛋白盐析；样本盐浓度比较高还会导致蛋白往两边扩散，使得条带越来越宽，最后条带连在一起；也可能会导致泳道内部电流偏大，最后出现笑脸的条带。

③ 根据目的蛋白定位选择合适的去垢剂裂解液，常见的去垢剂有 Triton X-100、NP40、SDS 等，不同的裂解液提取强度不同，其中 SDS 及其他离子型去垢剂的裂解液溶解能力最强，最有可能获得最高的得率，但是会破坏蛋白-蛋白之间的相互作用，不适合 Co-IP 或者 Pull down 这类实验，如果想尽量保护蛋白-蛋白相互作用，避免蛋白变性，需要选择温和的非离子型去垢剂（例如 Triton X-100），或者直接用 Tris-HCl，PBS 这类不含去垢剂的缓冲液借助物理破碎提取可溶蛋白。

④ 提取的样本要尽可能的新鲜，裂解前几分钟加相应的酶抑制剂，提取时间要充足，提取全过程要保持低温操作，使用的试剂和耗材要提前遇冷，提取后的样本保存过程中要避免多次反复冻融。

⑤ 如果提取的蛋白样本出现透明胶状物，该透明胶状物为含有基因组 DNA 等的复合物，需要借助冰上超声破碎，来降低样本粘稠度，会使得核蛋白得到最大释放。

⑥组织样本如果血液含量比较多，要多清洗几次尽量把血液去除干净，或用组织红细胞裂解液处理后再进行蛋白提取，因为血液会影响蛋白浓度测定，以及血液中可能存在 IgG 会干扰后续的抗体反应。对于易破碎软组织（如肝脏，脑等），可以剪碎之后加入适量的裂解液，利用玻璃匀浆器进行充分研磨后冰上裂解 10-30 min。对于硬度大或韧性强组织（如骨组织、皮肤组织等）、易降解样品（如消化系统相关组织）可以先液氮研磨成细粉，再加入适量裂解液进行裂解。

无论您是刚开始接触 Western Blot 实验，还是已经是 Western Blot 实验老手，我们都要时刻注意样本制备的细节，为 Western Blot 实验夯实地基，才能不浪费我们宝贵的时间、精力和试剂。以上就是易孛特今天分享的全部内容，有需要的记得点赞收藏哦，如有不确定的地方，可以直接留言进行交流。

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