恒光讲堂｜实时显示肿瘤：一种可用于近红外二区(NIR-II)成像和术中肿瘤切除的高灵敏度PSMA探针

本文要点：前列腺特异性膜抗原(prostate -specific membrane antigen, PSMA)是原发性和转移性前列腺肿瘤细胞膜上过表达的一种II型跨膜糖蛋白，PSMA的表达水平与前列腺癌分期和Gleason评分呈正相关，因此，PSMA可作为一种评估PCa（前列腺癌）的有效生物标志物。

现如今尽管已经开发出几种治疗前列腺癌的药物，根治性前列腺切除术仍然是最有效的治疗方法和早期患者的首选，但是前列腺癌(PCa)由于其复杂的解剖结构，在保留癌旁组织的同时对肿瘤进行精确切除是一个挑战。前列腺特异性膜抗原(prostate -specific membrane antigen, PSMA)是原发性和转移性前列腺肿瘤细胞膜上过表达的一种II型跨膜糖蛋白，PSMA的表达水平与前列腺癌分期和Gleason评分呈正相关，因此，PSMA可作为一种评估PCa（前列腺癌）的有效生物标志物。近年来已经开发出了一些针对前列腺特异性膜抗原（PSMA）进行光学成像的探针，如CY7-3、CY7-2和L16(图1a)，它们在磷酸盐缓冲液(PBS)中的发射最大波长分别为767、767和800 nm，这些探针存在着近红外一区（NIR-I）探针固有的缺点，例如穿透组织能力差，分辨率有限。近红外二区 (NIR-II，1000-1700 nm)成像自体荧光水平较低，光子散射小，穿透能力强、具有高时空分辨率和高灵敏度的特点，可以显著提高成像质量，可用于肿瘤切除术中导航。

作者在本文中设计、合成了一种带有两个前列腺特异性膜抗原(PSMA)结合基元的探针(PSMA-1092)，该探针具有优异的光学性能(λmax= 1092 nm)，对PSMA具有超高亲和力(Ki= 80 pM)。采用PSMA-1092探针进行小鼠NIR-II成像，可以高分辨率显现肿瘤(TNR= 7.62±1.05)，边缘清晰，然后，作者将PSMA-1092用于小鼠前列腺肿瘤切除术中导航，在肿瘤切除过程中，NIR-II成像可对肉眼检查遗漏的残余肿瘤进行实时成像检测。总的来说，PSMA-1092在描绘肿瘤边缘和检测残余肿瘤方面表现良好，在临床实践中显示了精确切除PCa肿瘤的潜力。

图1：(a)以前报告的PSMA荧光探针的结构。蓝色表示结合基序，紫色表示NIR-I区的荧光团。(b)新设计的NIR-II PSMA探针的结构。

考虑到供体-受体-供体(D−A−D)核心结构以及合适的电子受体和电子供体部分是获得NIR-II近红外二区荧光探针的关键因素，作者选择苯二联体(1,2,5-噻二唑)部分作为优良的电子受体，共轭二甲基苯胺作为电子供体。以两个((S)5-氨基-1-羧基)氨基甲酰)- l -谷氨酸(Glu-urea-Lys)作为与PSMA特异性结合的基团，通过酰胺键与荧光团部分结合，增强了探针与PSMA的亲和力(图1b)，此外，Glu-urea-Lys基团上的三个羧基也使探针具有较强的亲水性，显著提高了探针在水溶液中的溶解度，PSMA-1092探针的合成路线如下（方案1）。

方案1：试剂和条件:(a)丙烯酸、乙酸(20% in H2O)，100℃，隔夜，94.5%; (b)叔丁醇、DCC、DMAP、CH2Cl2，室温，隔夜，43.2%;(c)六丁基二锡烷, Pd(PPh3)4，甲苯，N2, 120℃, 2 h;(d) 4,7-二溴-5,6-二硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑，PdCl2(PPh3)2，甲苯，N2, 120℃,2 h, 7.7%;（e）铁粉，醋酸，100℃，30分钟，36.2%;(f) PhNSO, TMSCl，干吡啶，80°C，过夜，27.2%;(g) TFA, CH2Cl2，室温，4 h, 100%;(h) 2,3,5,6-四氟苯酚，DCC, CH2Cl2，室温，5 h, 67.4%;(i)二叔丁基(((S)-6-氨基-1-(叔丁基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酰)- l –谷氨酸，Et3N, CH2Cl2，室温，6 h, 61.3%。

PSMA-1092探针由于D-A-D结构中强烈的分子内电荷转移(ICT)效应，其荧光发射峰在1092 nm处测得(DMSO，图2a，b)，该峰位于近红外二区，为了验证PSMA-1092的光稳定性，将其二甲基亚砜溶液暴露于激光(727nm，10W)进行30分钟的连续辐射，没有观察到明显的光降解(图2c)，表明其出色的光稳定性。在PBS中测得PSMA-1092的量子产率为6.66%，这对于近红外二区成像来说是足够高的。利用近红外成像系统，在不同的滤光片下进一步比较了PSMA-1092在PBS中的近红外荧光信号。PSMA-1092溶液在1000和1200nm LP滤光片下可见，而在1300或1400纳米滤光片下未检测到信号(图2d)。考虑到在1000nmLP滤光片下的荧光信号比其他滤光片更强，选择1000nmLP滤光片用于进一步的体内近红外二区成像。总的来说，该探针具有良好的荧光发射波长、较大的Stokes位移和优异的光稳定性，在体内NIR-II近红外二区成像方面具有很大的潜力。

图2：(a) PSMA-1092的光学特性。在DMSO中最大吸收(λex1)和发射(λem1)波长。PBS中测量的量子产量。在酸性水溶液(pH = 2.66)中测定吸收光谱(λex2)和发射光谱(λem2)。Ki（受体亲和力指数）通过LNCaP细胞（人前列腺癌细胞）裂解液的抑制实验测定。Pka（结合常数）是根据Boltzmann曲线计算的。(b) PSMA-1092 (10 μM)在DMSO中的紫外-可见-近红外吸收光谱和荧光发射光谱。(c) PSMA-1092 (10 μM)在727 nm连续激光照射DMSO中的光稳定性。(d) PSMA-1092 (0.43 mM)在PBS中与各种LP滤光片的NIR-II成像。白色虚线勾画出了不可见的溶液。

此外，作者观察到PSMA-1092的荧光性质在不同pH值的溶液中发生了显著变化(图3a,b)，肉眼可以观察到PSMA-1092溶液暴露在酸性溶液中，在自然光下由青色变为亮粉色(图3c)，在365 nm紫外光下(图3d)或在NIR-I成像中(图3e)可以观察到荧光逐渐增加。荧光光谱显示，荧光极大值从1092 nm蓝移至620 nm,且随着溶液酸度的增加，620nm处的荧光强度随着溶液酸度的增加而大大提高(图3a,b)，当溶液pH从7变到0.3时，PSMA-1092溶液的荧光强度增加了85倍。此外，PSMA-1092在620 nm处的荧光强度图与pH值的Boltzmann曲线拟合良好(R2= 0.9984)，计算得到pKa为1.95(图3b)。PSMA-1092的pH响应突出了其在更广泛领域的应用潜力，比如在非侵入性测量胃液pH值时，从NIR-II区域到NIR-I区域的巨大波长位移可以有效地避免原始波长的影响，从而提高了检测精度，进一步的pH响应应用作者仍在研究当中。

为了进一步测试PSMA-1092的体内性能，我们使用皮下LNCaP（人前列腺癌细胞）荷瘤小鼠(n = 3)进行NIR-II成像。尾静脉注射PSMA-1092（剂量为2.5毫克/千克体重），在不同的时间点(1、2、4、6、8、12、24 h,图4) （792nm激光激发，100 mW / cm2 功率密度 ）(1000 nmLP滤光片,50 ms曝光时间)进行NIR-II成像。如图4所示，PSMA -1092在注射后2小时内在肿瘤及周围组织中积累(图4c)。注射后4小时，肿瘤与周围组织区别开来，具有良好的对比度(图4d)，并且在随后的时间点保持了高质量图像 (图4e-h)，这表明成像性能优异且在小鼠模型中具有高稳定性。为了获得更详细的药代动力学信息，进行了基于近红外图像的肿瘤与正常组织比率(TNR)的半定量分析。由于PSMA-1092在正常组织中的清除速率快于在肿瘤中的清除速率，因此在注射后6小时达到最大肿瘤摄取量，而在注射后12小时获得TNR峰值(7.62±1.05，图4j)。根据劳斯判据，至少需要5的TNR才能100%区分图像特征。在近红外二区成像中，PSMA-1092的TNR值在注射后8小时达到5.99±0.72，并在随后的时间点保持高水平(注射后12小时为7.62±1.05，注射后24小时为6.66±1.48，图4j)，TNR值始终高于劳斯判据，可实现高质量的近红外二区成像。为了验证PSMA-1092对PSMA的特异性，我们进一步对荷瘤小鼠进行了阻断实验(每组n=3)。联合注射2-PMPA(一种强效和选择性的谷氨酸羧肽酶II抑制剂，IC50=300 pM，34.3 mg/kg体重)和PSMA-1092 (2.5 mg/kg体重)后于选定时间点获得NIR-II图像(792 nm激光激发，1000 nm LP滤光片，50 ms曝光时间)。只注射PSMA-1092 (2.5 mg/kg体重)的荷瘤小鼠作为对照，如图4k所示，在阻断组中，活体小鼠的大部分肿瘤信号可被2-PMPA抑制，半定量分析表明，注射后6 h，对照组的TNR值远高于阻断组(图4m)，进一步的离体成像显示，联合注射2-PMPA和PSMA1092后，来自肿瘤和肾脏的荧光信号被成功降低(图4l)。这些结果很好地证明了PSMA-1092是PSMA的特异性配体，具有超高的亲和力，满足了NIR-II探针的成像需求。

为了验证PSMA-1092在肿瘤切除手术中进行精确荧光图像导航的可行性，作者选择活体LNCaP（人前列腺癌细胞）荷瘤小鼠在麻醉下进行肿瘤切除试验。根据上述影像数据，选择在尾静脉注射PSMA-1092 (2.5 mg/kg体重) 24 h后作为手术的最佳时间窗，以获得最低背景信号。在整个手术过程中，小鼠以0.4 L/ min的速度被异氟醚和氧气联合气体麻醉，在NIR-II近红外二区导航下切除肿瘤，整个过程由显像仪记录。首先，解剖肿瘤区域周围皮肤，暴露肿瘤(图5b,c)。半定量分析显示，切除覆盖皮肤后，TNR值增加(从7.95增加到9.81，图5n)。然后切除肿瘤(图5d,f,g)，肉眼检查认为肿瘤已完全切除。但周边仍可见强烈的荧光信号(图5i)， TNR值为5.48(图5n)，提示手术边缘仍有遗漏的残余肿瘤。在NIR-II荧光成像引导下，进一步切除残余肿瘤(图5j)，同时尽可能保持健康组织，切除后TNR值降至3.12(图5n)。但扩大切除后，剩余组织中仍能检测到荧光信号(图5j)。进一步检查发现漏诊的微小肿瘤(图5k,l，红色箭头所示)，再进一步切除肿瘤，影像学检查未见残留荧光信号(TNR = 2.97，图5m,n)。苏木精和伊红(H&E)染色的组织学研究表明，切除的肿瘤是低分化癌。总的来说，PSMA-1092探针具有出色的肿瘤描绘能力，在肿瘤切除术中导航方面具有临床转化潜力。

参考文献

Zhang Longfei et al. Visualizing Tumors in Real Time: A Highly Sensitive PSMA Probe for NIR-II Imaging and Intraoperative Tumor Resection.[J]. Journal of medicinal chemistry, 2021

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