利用成像监测肿瘤激活光动力疗法的比例NIR-II荧光有机纳米探针

本文要点：光动力疗法（PDT）因其非侵入性和高选择性而成为一种有前途的肿瘤治疗方法。然而，光毒性的脱靶激活和肿瘤特异性生物标志物的有限可用性等问题使PDT存在局限性 。本文介绍了一种新型比率型近红外二区（NIR-II）荧光有机纳米探针BTz-IC@IR1061，该探针对肿瘤内的次氯酸盐（HClO）有特异性反应。这种纳米探针通过比例荧光成像来监测和指导肿瘤活化PDT。BTz-IC@IR1061纳米颗粒是将产生活性氧（ROS）的小分子染料BTz-IC与商业染料IR1061共掺杂来合成的。利用HClO可选择性地激活 BTz-IC 的荧光和光动力特性，同时破坏 IR1061，从而控制 ROS 的释放用于肿瘤治疗。本文研究证明了纳米探针对HClO的高选择性，同时具有优异的光稳定性、光声成像能力和光热能力。此外，体内研究显示，通过肿瘤激活的光动力疗法，可以有效靶向肿瘤并显著抑制肿瘤生长。研究结果表明 BTz-IC@IR1061 在肿瘤特异性光动力疗法方面具有潜力，为精准和可控的癌症治疗提供了新的机会。

动物活体成像

方案1. 比率NIR-II FL成像引导激活PDT癌症治疗的示意图

在这项研究中，构建了一种新型比率型近红外二区（NIR-II） 荧光 （FL） 有机纳米探针 （BTz-IC@IR1061），该探针对肿瘤内的 HClO 有反应 （方案1)。该纳米探针实现了比率 FL 变化和 PDT 激活，PDT 的激活通过比例 NIR-II FL 变化进行监测。纳米探针由两个主要成分组成。第一种成分是有机小分子染料BTz-IC，它通过在传统供体-受体-供体（D-A'-D）核心的两端引入两个受体基团，扩展共轭系统以实现NIR-II FL 发射。在光照射下，BTz-IC分子产生羟基自由基（·OH）和单线态氧（1O2）通过I型和II型光动力过程。第二种成分是商业花青染料IR1061。当两个分子共掺杂时，观察到两个分子之间的荧光共振能量转移（FRET），BTz-IC的光动力性能也被淬灭。与HClO一起孵育后破坏了IR1061，恢复了BTz-IC分子的荧光和光动力特性。PDT后，肿瘤部位发生炎症，导致肿瘤内中性粒细胞浸润，HClO浓度升高，进而导致IR1061的破坏和肿瘤中比荧光和PDT的激活。最后，比率NIR-II荧光探针可以监测活化PDT治疗肿瘤过程。

图 1. BTz-IC分子的合成路线和表征

BTz-IC分子的合成方法如图1a所示。紫外和可见分光光度法（UV-vis）吸收光谱表明，BTz-IC分子在730 nm处有一个特征吸收峰（图1c）。此外，荧光光谱显示BTz-IC分子在850 nm至1100 nm范围内有强烈的发射（图1d）。此外，IR1061的吸收光谱范围为800nm至1100nm，与BTz-IC的荧光发射范围重叠（图1e）。因此，两个分子之间的FRET可以淬灭BTz-IC的荧光。为了进一步研究，使用表面活性剂DSPE-mPEG将这两个小有机分子组装成纳米粒子（图1b）。

最终使用的5:3比例合成了纳米探针，并对其形态进行了表征。透射电子显微镜（TEM）图像BTz-IC@IR1061展示了尺寸为31nm的对称球形纳米粒子（图1h）。此外，BTz-IC@IR1061纳米粒子表现出高水溶性，动态光散射（DLS）尺寸约为38 nm（图1 g）。TEM和DLS尺寸一致。与此同时BTz-IC@IR1061在不同时间的不同溶剂（H2O、1640细胞培养基、磷酸盐缓冲盐水（PBS））中没有显著变化，表明颗粒具有良好的稳定性。此外，测得的ζ电位为-25.1 mV。

图2. BTz-IC@IR1061纳米颗粒表征

通过用表面活性剂共掺杂这两个分子来合成BTz-IC@IR1061在纳米颗粒中，发生了FRET，淬灭了BTz-IC分子的荧光和光动力特性。在与ClO—孵育后，IR1061被破坏，从而恢复了BTz-IC分子的荧光和光动力特性（图2a）。为了验证纳米探针对ClO—的特异性响应，本文对探针的选择性进行了研究。选择了肿瘤中几种常见且高表达的分析底物，即谷胱甘肽（GSH）、H2O2、1O2、O2·−、·OH和ClO—。纳米探针分别与这些分析物一起孵育，如图2b所示，添加其他底物（GSH、H2O2、1O2、O2·−、·OH）后，1064 nm处的吸收变化可以忽略不计。相比之下，随着ClO—的加入，1064 nm处的吸收显著降低。此外，在ClO—响应前后测试了纳米粒子的粒径。在ClO—反应后，纳米粒子的大小没有变化，这有效地表明只有IR1061被破坏了。通过NIR-II荧光研究了选择性，如图2c所示。在与GSH、H2O2、1O2、O2·−、·OH充分反应后，808 nm和1064 nm激发的荧光保持不变。相反，当与ClO—反应时，由于IR1061的破坏导致FRET停止，808 nm激发的荧光增加，而1064 nm激发的荧光减少。此外，计算不同ROS反应前后808 nm/1064 nm激发的荧光比表明，添加ClO—后的荧光比为0.94，而GSH、H2O2、1O2、O2·−、·OH和水的荧光比分别为0.32、0.29、0.30、0.31、0.32和0.32。总之，BTz-IC@IR1061仅对ClO—显示出高选择性（图2d）。

在研究了纳米探针的选择性后，研究者开始验证BTz-IC@IR1061纳米粒子在不同浓度ClO—下的反应。将纳米探针置于不同浓度的ClO—中，并测量其吸收和荧光。随着ClO—浓度的增加，808 nm处的吸收保持不变，而1064 nm处的吸光逐渐降低。这一趋势表明，尽管内部参考分子BTz-IC不受影响，但IR1061逐渐被破坏。ClO—的检测限为0.62μmol/L（图2e）。此外，如图2f和g所示，随着ClO−浓度的增加，808 nm激发下的荧光增加，而1064 nm激发下的荧光减少。计算不同ClO−浓度下808 nm/1064 nm的荧光比，结果显示，在20 μmol/L浓度下，荧光比高达123.25，而在0 μmol/L浓度时，荧光比为0.13（图2h）。总之，该探针对ClO—表现出优异的检测性能，并显示出体内研究的潜力。

图3. NIR-II荧光成像监测ClO—活化PDT

接下来，研究了ClO—激活BTz-IC@IR1061纳米粒子进行光动力疗法的性能，以验证光动力疗法的激活是否可以通过比率荧光监测（图3a）。通过使用不同浓度的ClO—与5:3的BTz-IC与IR1061反应，验证了PDT的激活（图3b和c）。在808 nm激光照射30秒后，1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）在415 nm处的吸收随着ClO—浓度的增加而显著降低。这一结果归因于随着ClO—浓度的增加，纳米探针之间的FRET受到更严重的破坏，导致BTz-IC分子的光动力恢复并增强。此外，计算了照射30秒后415nm处的吸收（At）与照射前的吸收（A0）之比（At/A0）（图3d）。在ClO—浓度为20 μmol/L时，该比值为0.591，而在0μmol/L ClO—时，该比率为0.879，表明ClO—反应后PDT完全激活。

根据DPBF检测到的ROS吸收变化，即使在极低激光照射条件（0.1 W/cm2）下照射10 s，415 nm处的峰值也急剧下降。这一观察结果表明在分子的PDT过程中产生了大量的ROS，能够通过I型光动力学过程生成·OH等自由基，通过II型光动力学过程生成1O2。以5,5-二甲基-1-吡咯烷N-氧化物（DMPO）和4-氧代-2,2,6,6-四甲基哌啶（TEMP）分别作为·OH和1O2的捕获剂，通过电子自旋共振（ESR）证实了这一点。在光照射下，出现了TEMP/1O2加合物和DMPO/·OH加合物的特征共振信号峰，表明纳米探针能够同时生成·OH和1O2（图3e和f）。此外，在水中加入 ClO− 进行激光照射不会引起捕获剂的特征峰出现，表明 ClO− 反应后 PDT 的激活不涉及 ClO− 与捕获剂的反应。因此，纳米探针表现出优异的 ClO− 激活 PDT 和荧光性能的恢复，这是由于 BTz-IC 和 IR1061 之间的FRET 被破坏所致。

对纳米探针 BTz-IC@IR1061 的光稳定性进行了检测，即使在用 808 nm 激光照射 16 分钟后，纳米探针的紫外光谱仍保持不变，表明其具有良好的光稳定性（图 3g）。

此外，还研究了纳米探针的光声成像和光热能力。纳米探针在暴露于 808 nm 光时会产生热量，与 ClO− 孵育后其光热性能不受影响。此外，纳米探针还表现出光声成像能力，光谱中具有 BTz-IC和 IR1061 的特征峰（图 3h 和 i）。这些发现为进一步研究在细胞和体内水平上使用纳米探针对肿瘤进行成像和治疗奠定了基础。

图4. BTz-IC@IR1061NPs不同时间两个通道的NIR II荧光图像（808 nm，Em>900 nm；1064 nm，Em>1100 nm）

BTz-IC@IR1061 纳米探针在 ClO− 激活的 PDT 中表现出良好的特性，表现出优异的光稳定性、光声成像、光热效应以及产生 ROS 杀死癌细胞的能力。这些发现支持了纳米探针在肿瘤 PDT 中的潜在应用。

在验证了纳米探针在溶液和细胞中均表现出显著的 PDT 特性后，对癌症的体内成像进行研究。研究者在 4T1 肿瘤小鼠模型中检查了 BTz-IC@IR1061 的肿瘤富集效果。在患有皮下 4T1 肿瘤的 BALB/c 小鼠中静脉注射 200 μL BTz-IC@IR1061 纳米粒子（2 mg/mL），并在不同时间点捕获光声和 NIR 荧光图像。肿瘤部位的光声亮度随时间逐渐增加，在注射后 8 小时达到峰值。此外，使用NIR-II荧光成像设备收集了通过静脉注射纳米粒子的小鼠荧光图像。这些图像显示在808 nm和1064 nm激发下肿瘤区域的高对比度逐渐增强（图4a），同时NIR-II荧光信号随时间增加。值得注意的是，两个激发通道中的荧光强度均随时间增加。具体而言，在808 nm激发下，肿瘤区域的荧光在4小时时达到最大值，而在1064 nm激发下，荧光强度呈现初始增加，然后降低，然后再次增加的模式。此外，在静脉注射纳米粒子4小时后，肿瘤区域的荧光在808 nm处达到最大值，而1064 nm处的荧光最低（图4b和c）。这项观察表明，纳米探针在最初到达肿瘤部位时，被肿瘤内存在的 ClO− 部分激活，随着时间的推移，其肿瘤富集度增加，导致 1064 nm 处的荧光逐渐增加。来自肿瘤区域的可辨别的 NIR-II 荧光信号表明 BTz-IC@IR1061 纳米粒子通过EPR 效应具有有效的肿瘤靶向能力。

患有 4T1 肿瘤（小鼠乳腺癌）的 BALB/c 小鼠瘤内注射 50 μL BTz-IC@IR1061 纳米探针，30 分钟后用 808 nm 激光照射7 分钟（0.4 W/cm2）。图 4d中所示的结果显示，激光照射 1 小时后，1064 nm 处诱导的荧光与照射前水平相比逐渐降低，而 808 nm 处诱导的荧光则增加。相反，未接受激光照射的小鼠的荧光信号没有显著变化（图4f 和 g）。将 808 nm 和 1064 nm 之间的荧光比标准化后，观察到肿瘤照射 1 小时后荧光比增加了约 6 倍（图 4e）。为了研究荧光比率变化的原因，使用了商业 Gr-1 荧光探针来评估照射后不同时间点肿瘤中的中性粒细胞表达。如图 4h 所示，照射后不同时间间隔内组织切片中 Gr-1 的荧光逐渐增加，随后降低。这种模式可能归因于照射后肿瘤内的炎症，导致中性粒细胞计数增加，荧光强度在 8 小时时达到峰值，随后下降。现有文献表明，中性粒细胞计数的增加会促进肿瘤内 ClO− 浓度升高。因此，肿瘤内 ClO− 对 IR1061 的逐渐降解可能导致了荧光比率的变化。此外，荧光的变化可以激活 PDT，从而允许通过比率荧光的变化监测肿瘤治疗。

对BTz-IC@IR1061 纳米粒子评估其在小鼠中的治疗效果。对患有4T1皮下肿瘤的BALB/c小鼠进行四种治疗条件：（i）PBS；（ii）808nm激光；（iii）BTz-IC@IR1061纳米粒子；（iv）BTz-IC@IR1061纳米粒子+808nm激光。如图5a中的时间线所示，在肿瘤内注射50μL BTz-IC@IR1061纳米探针30分钟后，对肿瘤进行7分钟的预照射，一小时后进行第二次PDT治疗。治疗后每隔一天测量一次肿瘤体积。从肿瘤生长曲线可以看出，用BTz-IC@IR1061+808nm激光治疗的小鼠表现出更强的抑制效果，治疗14天后肿瘤完全消失。相反，对照组小鼠的肿瘤生长逐渐加剧（图5b）。此外，治疗14天后，各治疗组小鼠体重均无明显变化（图5c），表明PDT对皮下肿瘤的有效性和生物安全性。治疗24小时后，对小鼠实施安乐死，并对肿瘤进行病理检查。组（iv）肿瘤切片经苏木精和伊红（H&E）染色后，与其他组相比病理变化明显，进一步证实了PDT对治疗实体肿瘤的有效性（图5d）。此外，治疗14天后，主要器官未见明显异常，表明该给药方法具有很高的生物安全性（图5e）。

图5. 小鼠PDT治疗

总之，本研究描述了一种新型比率型 NIR-II 荧光有机纳米探针，该探针被命名为 BTz-IC@IR1061。该纳米探针由具有 A-D-A'-D-A 共轭结构的有机小分子染料 BTz-IC 和商业染料 IR1061 组成。值得注意的是，BTz-IC 既可以通过 I 型光动力过程生成 ·OH，又可以通过 II 型光动力过程生成 1O2。当通过表面活性剂组装成亲水性纳米颗粒时，两种有机分子之间会发生 FRET，从而导致 BTz-IC 的荧光和光动力活性猝灭。当 IR1061 被 ClO− 破坏后，BTz-IC 的荧光和 PDT恢复，从而有利于比例 BTz-IC 荧光成像以监测 PDT。此外，首次PDT导致肿瘤部位中性粒细胞浸润，随后HClO浓度升高，进一步导致NIR-II荧光比例变化并激活PDT，此外，可以通过比例型NIR-II荧光变化来监测肿瘤PDT的治疗情况。

参考文献

Yin B, Liu X, Li Z, et al. Ratiometric NIR-II fluorescent organic nanoprobe for imaging and monitoring tumor-activated photodynamic therapy[J]. Chinese Chemical Letters, 2024: 110119.