溶酶体靶向的 NIR-II 荧光探针指导 pH 激活的鼻咽癌光疗

本文要点：目前，鼻咽癌（NPC）的临床治疗策略面临手术切除不完全、化疗/放疗副作用显著等难以克服的困境。光疗为鼻咽癌治疗提供了一种可操作、有效和非侵入性的模式。本文开发了一种溶酶体靶向和 pH 响应的纳米光疗诊断剂，用于鼻咽癌的近红外二区（NIR-II） 荧光成像引导光动力疗法 （PDT） 和光热疗法 （PTT）。溶酶体靶向 S–D–A–D-S 型 NIR-II 光疗分子 （IRFEM） 封装在酸敏感两亲性 DSPE-Hyd-PEG2k 中，形成IRFEM@DHP纳米颗粒 （NPs）。制备的IRFEM@DHP在酸性溶酶体中表现出良好的积累，促进了IRFEM的释放，IRFEM在激光照射下会产生大量的热量和ROS，从而破坏溶酶体功能。此外，NIR-II荧光的指导提高了PTT/PDT对鼻咽癌的准确性，避免了对正常组织的损伤。值得注意的是，IRFEM@DHP体外和体内都能实现有效的抗肿瘤作用，为精确的鼻咽癌治疗诊断开辟了一条新途径。

动物活体成像

方案 1. 鼻咽癌 NIR-II 荧光成像引导溶酶体靶向光疗的 IRFEM@DHP

在这项工作中，开发了一种溶酶体靶向和pH响应的光疗纳米平台，用于NIR-II荧光成像引导的鼻咽癌PTT/PDT联合治疗（方案1）。首先，基于之前报道的IR-FE分子合成了一种有机S-D-A-D-S型分子（IRFEM），研究者对此进行了轻微的修改。IRFEM分子具有四个吗啉基团的功能化，因此具有出色的溶酶体靶向能力。然后，用酸敏两亲性共聚物DSPE-Hyd-PEG2k包封IRFEM，得到IRFEM@DSPE-Hyd-PEG NPs（IRFEM@DHP）。IRFEM 旨在实现荧光、热量和 ROS 生成能力的平衡，因此使其成为 NIR-II 成像引导的 PTT/PDT 联合治疗的理想候选者。制备的IRFEM@DHP可以通过增强渗透性和保留率（EPR）效应在鼻咽癌细胞中富集，然后倾向于在酸性溶酶体中积累以释放IRFEM。之后，IRFEM可以通过大量的吗啉特异性靶向溶酶体，并在光照射下产生大量的热量和ROS，从而诱导基于溶酶体的细胞死亡。总而言之，该IRFEM@DHP为鼻咽癌准确的治疗诊断提供了几个显着的好处：（i）广泛而强烈的NIR-II发射提供了深度穿透的肿瘤成像，以促进精确光疗。（ii）通过S-D-A-D-S型分子的模块化设计，可以操控产生PTT和PDT协同作用的特定光物理过程，从而提高肿瘤根除能力。（iii）溶酶体靶向能力进一步延长了IRFEM@DHP的保留时间，提高了PDT/PTT消除肿瘤细胞的效率。

图1.  RFEM@DHP 的表征

如图 1a 所示，IRFEM@DHP呈现出球形结构，平均直径为 124.9 ± 2.2 nm。平均流体动力学直径和多分散指数（PDI）结果表明，IRFEM@DHP在7天内相对稳定。该IRFEM@DHP表现出 600 至900 nm 的强吸收范围，当在 808 nm 激发时，最大荧光发射峰位于 1030 nm（图 1b）。此外，还系统地研究了IRFEM@DHP的光热性质。在808nm激光照射下，IRFEM@DHP溶液（60 μM）的温度随着激光功率密度的增加而升高（0.25–1.25 W/cm2）（图1c）。同样，不同浓度（10-100 μM）的IRFEM@DHP的温度也随着808 nm激光照射（1.0 W/cm2）而升高(图1d）。此外，通过分析加热和冷却过程，确定IRFEM@DHP的光热转换效率为32.3%（图1e）。IRFEM@DHP的出色光热稳定性表现在五个开关周期内的变化可以忽略不计。这些结果表明，IRFEM@DHP具有优异的光热性能，在肿瘤PTT中具有巨大的潜力。使用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针评估IRFEM@DHP的ROS生产能力，该探针可以通过ROS灵敏地转化为荧光二氯荧光素（DCF）。如图 1f–i 所示，IRFEM@DHP 在 808 nm 激光照射下呈现出恒定的 ROS 生成，这可以通过在 525 nm 处持续增强的荧光强度来证明。相比之下，IRFE@DHP辐照下的荧光强度随时间变化不大。这些结果表明IRFEM@DHP具有良好的光动力性能。

图2. IRFEM@DHP 的细胞摄取和溶酶体相关检测

使用激光扫描共聚焦显微镜 （CLSM） 评估 5-8F 细胞对 IRFEM@DHP 的摄取能力。细胞内荧光随时间（0-6 小时）稳步增加，表明 5-8F 细胞IRFEM@DHP表现出有效摄取。为了进一步证实其溶酶体靶向能力，进行了细胞内溶酶体共定位成像。溶酶体示踪红 （LTR） 结合 IRFEM@DHP 用于鉴定溶酶体并评估其重叠。如图2a所示，Pearson相关系数（PCCs）结果显示IRFEM@DHP的荧光信号（蓝色）和LTR（红色）之间存在显着重叠，PCC值为90.6%。相比之下，确定的IRFE@DHP共定位的 PCC 值相对较低，为 33.0%。如图 2b 所示，IRFEM@DHP 和LTR 之间的线性区域中的强度分布完全重叠。这些结果证实，由于吗啉的存在，IRFEM@DHP可以有效地靶向溶酶体，为通过溶酶体细胞死亡（LCD）途径精确根除肿瘤细胞提供了可能性。

细胞毒性ROS可有效损伤溶酶体，诱导细胞死亡。在 808 nm 激光照射后，通过 DCFH-DA 探针评估细胞 ROS 的水平。如图 2c 所示，在 5–8F 细胞的 IRFEM@DHP+NIR 组中观察到最强的绿色荧光，表明 IRFEM@DHP 在 808 nm 激光照射下产生一定量的 ROS。值得注意的是，基于ROS的荧光定量分析，与IRFE@DHP+NIR组相比，IRFEM@DHP+NIR组的荧光强度高18.9倍，证实了吗啉的引入增强了IRFEM@DHP ROS的产生。采用溶酶体膜通透性试验，阐明IRFEM@DHP诱导LCD的机制。使用吖啶橙（AO）染料可以确认溶酶体膜的完整性，因为AO在酸性溶酶体中捕获时会发出红色荧光，由于溶酶体质子梯度紊乱，AO会泄漏到胞质溶胶中，从而转化为绿色荧光。如图 2c 所示，IRFE@DHP 组和 IRFEM@DHP 组之间的红色荧光没有明显差异，表明在没有照射的情况下细胞损伤最小。然而，由于光热效应诱导的溶酶体膜完整性丧失，IRFE@DHP+NIR组和IRFEM@DHP+NIR组的红色荧光明显下降。此外，由于IRFEM@DHP+NIR组的红色荧光明显低于IRFE@DHP+NIR组，这是由于IRFEM@DHP具有突出的溶酶体靶向性和ROS生成能力。

图3. 用不同浓度的 IRFE@DHP和 IRFEM@DHP处理的 5-8F 细胞的细胞活力，有或没有 808 nm 激光照射

通过 CCK8 测定法评估 IRFEM@DHP 和 IRFE@DHP 对 5-8F 细胞的深色和浅色细胞毒性。如图3a，b所示，在激光照射下IRFEM@DHP或IRFE@DHP细胞的活力比没有激光照射的细胞活力低。探索了 IRFEM@DHP 对正常细胞 HC11 和 GES-1 的深色细胞毒性，发现它对正常细胞也无毒。IRFEM@DHP+NIR组的细胞活力为14.64%，明显低于IRFE@DHP+NIR组的19.05%，表明IRFEM@DHP的光热效应而非光动力效应在治疗过程中占主导地位。为了直观评估细胞毒性，使用钙黄绿素乙酰氧基甲酯 （Calcein-AM） 进行活/死染色测定，用绿色荧光染色活细胞，使用碘化丙啶 （PI） 用红色荧光染色死细胞。如图 3c 所示，在没有近红外光照射的情况下，处理 IRFEM@DHP 和 IRFE@DHP 可以观察到广泛的绿色荧光和可忽略不计的红色荧光。激光照射后，与IRFEM@DHP或IRFE@DHP孵育后死细胞数量显著增加，IRFEM@DHP的抗肿瘤效果比IRFE@DHP更明显。这些结果强调了 IRFEM@DHP 对 NPC 细胞的卓越 PDT 和 PTT 能力。

图4. 5-8F 荷瘤小鼠在注射后 0.5、1、2、5、8、12、24 和 48 小时处理IRFE@DHP 和 IRFEM@DHP 的实时荧光图像

为了研究IRFEM@DHP的生物分布，使用携带5-8F肿瘤的雌性裸鼠通过体内成像系统在不同的间隔（0.5, 1, 2, 5, 8, 12, 24和48小时）监测荧光信号（图4a）。尾部静脉给药后IRFEM@DHP，捕获肿瘤的NIR-II图像。结果显示，荧光信号在0.5-24小时内增强，表明肿瘤位置的IRFEM@DHP逐渐积累。荧光强度在注射后24小时达到峰值，随后下降（图4b）。这些成像结果表明，由于 EPR 效应增强，IRFEM@DHP在肿瘤部位表现出良好的积累。注射后48小时，小鼠被安乐死，主要器官和肿瘤被切除并成像。肝脏和脾脏显示出明显的荧光信号，表明肝胆和脾脏纳米颗粒具有明确的IRFEM@DHP和IRFE@DHP通路。肾脏和肺部荧光信号较高的原因可以概括为以下几点。首先，在弱酸性肿瘤组织中释放的IRFEM可以进入循环系统并被带入器官细胞，从而保留更长的时间以引起更高的荧光信号。其次，与其他组织和器官相比，肺部具有更多的巨噬细胞和发育良好的溶酶体，因此导致更高的IRFEM@DHP保留（图4c）。

图5. 5-8F 荷瘤小鼠模型体内构建和处理的示意图

为了评估IRFEM@DHP的体内生物安全性，在注射后15天收获小鼠的主要器官进行组织学检查（H&E染色）。结果表明，IRFEM@DHP组和对照组之间的主要器官组织没有明显的差异。收集所有小鼠的血样进行常规血液学和生化测定。结果表明，碱性磷酸酶（ALP）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、γ-谷氨酰转肽酶（gamma-GT）、肌酐（CREA）、尿素（UREA）、尿酸（UA）等生化指标在IRFEM@DHP组和PBS组间具有可比性，显示出IRFEM@DHP具有优异的体内生物相容性。这些结果凸显了IRFEM@DHP在抗肿瘤治疗中的临床转化潜力。

为了评估IRFEM@DHP的体内治疗效果，使用雌性裸鼠构建了 5-8F 荷瘤小鼠模型。如图 5a 所示，将 5-8F 荷瘤小鼠分为6 组（PBS、PBS+NIR、IRFE@DHP组、IRFE@DHP+NIR、IRFEM@DHP 组和 IRFEM@DHP+NIR 组）。注射24小时后，将辐照组暴露于808nm激光（1.0W/cm2，10 分钟）。热成像结果显示，IRFEM@DHP+NIR组的温度显着升高了17.7°C。在整个治疗过程中每 2 天监测一次肿瘤体积。结果显示，肿瘤在PBS、PBS+NIR、IRFE@DHP组和IRFEM@DHP组中生长迅速。相比之下，在辐照IRFE@DHP组和IRFEM@DHP组中的肿瘤生长实现了更高的肿瘤抑制（图5b，c）。值得注意的是，由于靶向溶酶体PTT/PDT联合治疗，IRFEM@DHP+NIR组的肿瘤重量比IRFE@DHP+NIR组轻（图5d）。同时，所有组的体重都没有明显的波动意味着最小的副作用和IRFEM@DHP的出色生物相容性（图5e）。

在治疗结束时，从小鼠身上取出肿瘤，称重并拍照。采用H&E、Ki-67法评估肿瘤组织的形态特征、细胞增殖和凋亡情况Ki-67 和 TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记 （TUNEL） 测定（图 5f）。与其他组相比，IRFEM@DHP+NIR组肿瘤细胞形态明显坏死，细胞轮廓模糊，细胞核消失。最低 K我在IRFEM@DHP+NIR组中也监测到Ki-67阳性信号和最强的TUNEL信号，表明辐照IRFEM@DHP能有效诱导癌细胞凋亡。因此，这些结果凸显了溶酶体靶向PTT/PDT联合治疗的优异治疗效果。

综上所述，本研究开发了一种溶酶体靶向光疗诊断剂，用于鼻咽癌的NIR-II荧光成像引导PTT/PDT联合治疗。吗啉在IRFEM上的修饰使其对NPC具有精确的溶酶体靶向能力。因此，该IRFEM@DHP可以快速准确地定位溶酶体，触发IRFEM的pH响应性释放，在激光照射下通过PTT和PDT的组合引起溶酶体破裂。此外，IRFEM@DHP肿瘤中表现出出色的 NIR-II 荧光成像，显示出 NPC 光疗指南的显着积累。因此，制备的IRFEM@DHP具有出色的活体成像、良好的生物相容性和溶酶体靶向的抗肿瘤光疗，展示了精确鼻咽癌治疗诊断学的范式。

参考文献

Li Z, Yang S, Xiao H, et al. Lysosome-Targeted and pH-Activatable Phototheranostics for NIR-II Fluorescence Imaging-Guided Nasopharyngeal Carcinoma Phototherapy[J]. Bioconjugate Chemistry, 2024.