JCR | 不同siRNA混合条件对siRNA LNP结构的影响

脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle, LNP)已被广泛应用于递送siRNA和mRNA等核酸药物，其不仅保护RNA不被降解，并且促进了核酸向靶细胞和组织的递送。随着研究的深入，人们发现LNP中脂质分子和核酸的组装模式显著影响着下游的生物学性能，如细胞毒性、血液循环时间和负载RNA活性等。近期有研究报道通过调控LNP的脂质组成所形成的反六边形结构可有效提高siRNA在细胞内的基因沉默效率。因此，LNP内部结构解析对于核酸装载LNPs的研发和质量控制至关重要。目前，小角度X射线散射(small-angle X-ray scattering, SAXS)和小角度中子散射(small-angle neutron scattering, SANS）是对LNP内部结构和脂质定位分析最常用的技术手段，但以上两种方法严重依赖于特定大型仪器设备。因此，亟需开发一种通用性强的分析方法以评估LNP内部结构的分子组成。

近日，来自日本千叶大学的Keisuke Ueda团队在Journal of Controlled Release上发表了研究论文“NMR-based analysis of impact of siRNA mixing conditions on internal structure of siRNA-loaded LNP”。该文章利用溶液态¹H NMR探讨了不同制备方法所得siRNA LNP内部结构变化，并联合NMR、NanoFCM、SAXS和Cryo-TEM等多项技术探究了不同siRNA混合条件对所得siRNA LNP的分子组成和内部结构的影响。

一、siRNA-LNPs的制备工艺

如图1所示，作者选取4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA, MC3)为可电离脂质，并参考已商品化的LNP合成配方(MC3：DSPC：cholesterol：DMG-PEG = 50:10:38.5:1.5)，使用三种不同制备方法，以考察不同siRNA混合条件对siRNA-LNPs组装的影响。

01 预混合法

使用微流控混合器将含有siRNA的酸性溶液与脂质的乙醇溶液预先混合，随后使用磷酸盐缓冲盐溶液（PBS，pH 7.4)进行透析，制备siRNA LNPs。

02 后混合法(A)

在与预混合法相同的条件下，使用iLiNP装置将脂质溶液和不含siRNA的醋酸盐缓冲液(pH 4.0)混合，先制备得到空载的LNP；随后，将siRNA储存液加入到酸性的空LNP中，倒置混合后，用PBS(pH 7.4)透析所得混合物，制备混合后的LNP(A)。

03 后混合法(B)

用上述相同方法制备空LNP后，用醋酸盐缓冲液(pH 4.0)对其进行透析，随后将siRNA 储存液加入其中，倒置混合后用PBS(pH 7.4)透析，制备混合后的LNP(B)。

图1. siRNA LNPs的制备方法示意图

二、不同混合条件下siRNA-LNPs理化性质

DLS和Cyro-TEM结果显示装载有siRNA的LNP粒径较空LNP略大，且后混合法比预混合法得到的siRNA-LNPs粒径更大，并伴随着70 nm以上颗粒数量的增加。推测这一现象是由于在混合初期形成了粒径较大的LNP前驱体。Cryo-TEM成像下，空载LNP和siRNA LNPs形态无显著差别，即通过形态无法判断LNPs是否成功装载了siRNA分子。此外，RiboGreen核酸定量法显示三种制备方法所得LNPs的核酸包封率均超过95%，且无显著差别。

作者进一步使用NanoFCM在单LNP水平对siRNA的装载情况进行分析。结果显示三种方法制备的siRNA LNPs中空载LNP的比例均低于3.5%，且颗粒粒径大小（散射）与核酸装载量（荧光）呈正相关（图2a）。此外，在预混合法制备的LNPs中，大部分颗粒都位于红色虚线所划分的区域，即相似大小的LNP颗粒之间的siRNA负载变化较小，而后混合法制备的LNPs显示出更宽的粒径范围以及更强的荧光信号，即后混合法在提高LNP粒径的同时可提高单个LNP上siRNA的装载量。同时，SAXS测量结果显示，预混合和后混合的LNPs均形成了siRNA-MC3堆叠双层结构(图2b)。

图2. 不同方法制备的siRNA封装效率(a)和SAXS图谱(b)

三、混合条件对siRNA LNP组装结构的影响

如图3所示，NMR在分子水平表征进一步揭示了不同混合条件所得siRNA LNPs的组装差异。在预混合法所得LNPs中，由于siRNA和MC3之间的相互作用使其在整个LNP中均匀分布。而后混合法所得LNPs则存在siRNA富集和空siRNA的区域。这可能是由于在混合过程中，带正电荷的囊泡在局部高siRNA浓度的区域与之形成复合物，从而形成siRNA富集区域。而另外一些带正电荷的囊泡没有与siRNA发生相互作用，导致空siRNA区域的出现。此外，后混合法LNP(B)中siRNA富集和空siRNA区域比后混合法LNP(A)更明显，可能是由于早期乙醇的存在促进siRNA-MC3堆叠双层结构的均匀混合和形成。

图3. 不同混合条件得到的siRNA-LNP示意图

结合下游细胞实验，发现siRNA在LNPs中分布的均匀性会显著影响siRNA的沉默效率。基于NMR对siRNA LNP内部结构的表征，可揭示siRNA LNP的分子水平异质性，对于优化siRNA LNP制剂的制备条件具有重要意义。

展望

随着疫情的结束，RNA疗法研究方向转变为更广泛的治疗性疫苗或药物。不管是药物的包封工艺开发、分析方法开发还是终产品的质控，都需要全面了解核酸药物的性质。工欲善其事必先利其器，NanoFCM开创性地提出了一种高灵敏、快速、直接、无损的核酸药物解决方案，适用于siRNA LNP、mRNA LNP等多种核酸药物的综合表征，为mRNA疫苗等核酸纳米药物的研发和质量控制提供了重要的技术保障，这将极大加快核酸疗法的基础研究和临床转化进程。

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