“谁在主导土壤耐药活性”| PRECI SCS微生物单细胞分选仪与你共同探索

长春长光辰英生物科学仪器有限公司

2024/09/09 11:29

随着全球细菌抗生素耐药现象日益严重，其传播途径也成为一个不容忽视的问题。在过去的研究中，土壤耐药菌在传递抗生素耐药基因的过程中起着关键作用，活性细胞组分则在促进传播的过程中扮演着更为关键的角色。然而，由于土壤菌绝大多数尚未被培养，了解土壤中原生活性耐药菌并确定“谁在主导土壤耐药活性以及如何耐药”成为一个重大挑战。

依据重水标记拉曼检测（D₂O-Raman）的方法，长光辰英 PRECI SCS微生物单细胞分选仪配合宏基因组检测，为克服上述挑战提供了一种切实可行的分离策略，解决了土壤耐药菌中“谁在做什么以及如何做”的问题。

一、研究方法

选择三种受人类活动影响程度不同的土壤，去除土壤原有水分后，使用美罗培南、环丙沙星、头孢噻肟三种抗生素和重水与土壤共孵育24h。通过碘海醇梯度离心法提取全部土壤菌，然后在拉曼光谱仪下检测并统计重水标记峰。接着，利用PRECI SCS微生物单细胞分选仪免培养分离高耐药活性菌，最后进行宏基因组确定其对应的耐药基因。

图1 案例流程图

在该过程中，PRECI SCS微生物单细胞分选仪分离活性菌的过程仅需3步即可实现。

1）将经过拉曼检测的样品芯片放置到分选仪上，并放置细胞接收器，用于接收分离细胞。

2）在PRECI SCS微生物单细胞分选仪的镜下视野中选择之前拉曼检测中呈现高CD ratio的活性耐药菌。

3）调整分选激光的合适参数，点击分选，将细胞分选至接收器中。

图2 土壤活性耐药菌分离流程^[1]

二、研究结果

1. 土壤活性耐药菌拉曼检出

活性耐药菌代谢D₂O到体内后会代替部分C-H键为C-D键，在拉曼光谱上体现为C-H峰红移，产生C-D峰。计算C-D峰与C-D峰和C-H峰的比值（CD ratio），作为土壤菌活性标准，统计每个样品中的菌活性能够看出，三种抗生素孵育结果均表明人类活动影响下土壤耐药菌活性更高。

图3 三种不同土壤中耐药菌活性统计^[1]

2. 活性耐药菌单细胞分选与测序

上述含有C-D峰的活性耐药菌经过CD ratio的计算排序之后，选择了前2%进行单细胞分离（图4红色光谱部分）。

图4 归一化C-D比值后前2%的高活性菌^[1]

红色为高耐药活性菌拉曼光谱，绿色为低活性或休眠的土壤菌拉曼光谱

3. 土壤高耐药活性菌宏基因组测序

分离的单细胞经扩增后用于宏基因组检测。结果显示放线菌门、变形菌门和厚壁菌门是土壤中活性耐药菌的优势菌门（图5右），共包含31个种，这类具有活性的耐药菌在未筛选前的土壤中仅占一小部分（图5左），这说明抗生素筛选联合Raman-D₂O进行单细胞分离过程对土壤活性耐药菌的检出是十分必要的。

图5 宏基因组测序结果^[1]

左侧为耐药活性菌物种在土壤所有菌种中的占比，右侧为不同抗生素孵育下的优势活性菌菌门丰度统计

参考文献：

[1] Li, H. Z., Yang, K., Liao, H., Lassen, S. B., Su, J. Q., Zhang, X., Cui, L., & Zhu, Y. G. Active antibiotic resistome in soils unraveled by single-cell isotope probing and targeted metagenomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 119, e2201473119 (2022).

为什么选择PRECI SCS微生物单细胞分选仪？

过去的单细胞分选通常采用流式技术，一般需要复杂的前处理步骤和标记要求，对于环境微生物的探究，在基因未知情况下难以准确锁定功能菌或耐药菌。PRECI SCS微生物单细胞分选仪是基于激光诱导向前转移（LIFT）技术开发的一款针对微生物单细胞进行分选的设备，可在显微视野下直观、可视化地识别目标细胞，并将其精准分选出来。该方法操作简单，无需复杂前处理，且能应对土壤等复杂环境样品中杂质干扰等问题，对操作者的技术要求更低，适用范围更广。