供货周期: | 7天 |
品牌: | 博尔森 |
型号: | 50T/24S |
货号: | BES-2194BTK |
α-半乳糖苷酶(α-GAL)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、试剂一:临用前取 1 瓶加入 2.67 mL 蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂-20℃分装保存 4 周,避免反复冻融;
2、标准品:5 μmol/mL 的对硝基苯酚溶液。
产品说明:
α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能专一地催化α-半乳糖苷键的水解,主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要,种子萌发初期,其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗,为种子的萌发提供最初的能量来源,后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。
α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声破碎仪、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或培养细胞的处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 1000 万细菌或细胞加入 1mL
提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),15000g,4℃,离心 20min,取上清,置冰上待测。
2、组织的处理:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆;15000g,4℃,离心 20min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释:将标准液用蒸馏水稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL标准溶液待测。
3、 标准液稀释可参考下表:
三、α-GAL活性计算
1、标准曲线的建立:
根据标准管的吸光度(y,ΔA标准)和浓度(x,nmol/mL)建立标准曲线,将ΔA(y,ΔA测定)带入标准曲线中,计算样本生成的产物量x(nmol/mL)。
2、α-GAL活性计算
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg 组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL活力(U/mg prot)=(x×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=20x÷Cpr
(2)按样本质量计算
单位的定义:每g 组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL活力(U/g 质量)=(x×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=20x÷W
(3)按细菌或细胞数量计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL活力(U/104 cell)=(x×V反总)÷(1000×V样÷V样总)÷T=0.02x
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,蛋白浓度需要另外测定;V反总:反应体系总体积,0.5mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;1000:细胞或细菌总数,1000万;T:反应时间,0.5h。
注意事项:
提取液中含有使蛋白变性的成分,故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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