糖原磷酸化酶b（GPb）检测试剂盒 紫外分光光度法

糖原磷酸化酶 b (GPb)活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：50T/24S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 1.25 mL 蒸馏水，充分混匀；2-8℃保存 2 个月；

2、 试剂三：临用前加入 1.25 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；

3、 试剂四：临用前加入 1.25mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；

4、 试剂五：临用前每支加入 1 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；

5、 试剂六：临用前每支加入 1 mL 蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融；

6、 试剂七：临用前加入 4 mL 蒸馏水，充分混匀后-20 分装保存 4 周，避免反复冻融；

7、 工作液的配制：临用前根据实验所需用量，按照试剂一：试剂二：试剂三：试剂四 =740μL: 20μL:

20μL: 20μL（1T 的量）的比例，充分混匀，现用现配。

产品说明：

糖原磷酸化酶是糖原分解代谢中的关键酶，催化糖原的磷酸化反应。该酶分为有活性的糖原磷酸化酶 a（Glycogen phosphorylase a, GPa）和无活性的糖原磷酸化酶 b（Glycogen phosphorylase b, GPb）两种形式。糖原的分解主要在糖原磷酸化酶 a 的催化下进行。未添加激活剂时，糖原磷酸化酶 a 催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NADP 还原生成 NADPH，在 340nm 下测定 NADPH 上升速率，即可反映糖原磷酸化酶 a 活性。添加激活剂测定 GP（GPa 和 GPb）总活性，未添加激活剂时测定 GPa 活性，GP 活性-GPa 活性得到 GPb 活性。

在 340nm 下测定 NADPH 上升速率，即可反映糖原磷酸化酶 a 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、电子天平、可调式移液器、研钵/匀浆器、1 mL 石英比色皿、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 8000 g，4℃，离心 10 min，取上清置于冰上待测。

2、血清（浆）：直接检测。若有浑浊可以离心后取上清进行测定。

3、细菌或者细胞：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 340 nm，蒸馏水调零。

2、 工作液置于 37℃预热 5min。

3、 GPa 活性:在石英比色皿中依次加入 50 μL 样本、50 μL 试剂五、50 μL 试剂六、50 μL 蒸馏水、800 μL 工作液，立即混匀并计时，记录 340 nm 下 10s 时吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2。计算 ΔAGPa=A2-A1。

4、 GP 活性:在石英比色皿中依次加入 50 μL 样本、50 μL 试剂五、50 μL 试剂六、50 μL 试剂七、800 μL 工作液，立即混匀并计时，记录 340 nm 下 10s 时吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2。计算 ΔAGP=A4-A3。

三、 糖原磷酸化酶 b (GPb)活性计算

注意事项：

1、如果测定吸光值 ΔA＞0.8，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值，建议增加反应中的样本体积或者样本质量后再进行测定。

实验实例：

1、 称取 0.1 g 兔子肝脏组织，加入 1 mL 提取液，冰浴匀浆，8000 g，4℃条件下离心 10 min；取上清置于冰上待测。按照测定步骤操作，用石英比色皿比色后计算 ΔA_GPa=A2-A1=0.414-0.318=0.096，ΔAGP=A4-A3= 0.434-0.320=0.114,按公式计算活性：

GPb（U/g 鲜重）=321.54×(ΔAGP-ΔAGPa) ÷W =321.54×(0.114-0.096)÷0.1 =57.87U/g 鲜重

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！