供货周期: | 7天 |
品牌: | 博尔森 |
型号: | 100T/96S |
货号: | BES-2250BTK |
硝酸还原酶(NR)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 诱导剂储备液:用蒸馏水 10 倍稀释后使用,即取 10mL 诱导剂储备液加 90mL 蒸馏水,充分混匀。现配现用。
2、 试剂二:临用前加入 2 mL 提取液溶解,可分装后-20℃保存,避免反复冻融。-20℃保存 2 周。
产品说明:
NR(EC 1.7.1.3)广泛存在于植物中,是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶,也是诱导酶,对作物的产量和品质有影响。
NR 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐,NO3ˉ +NADH+H+→ NO2ˉ +NAD++H2O,NADH 在 340nm 下有特征吸收峰,340nm 下吸光值的变化即可表示酶活。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者=增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、取适量诱导剂于烧杯中,将新鲜标本洗净,滤纸吸干,放入诱导剂应用液中(淹没即可)避光,浸泡 2h,取出样本,滤纸吸干后,-20℃冷冻 30min,取出样本,滤纸吸干。(一般不需要诱导处理,预实验结果没有活性则需要进行诱导处理)
2、称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液,冰浴研磨,4000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、样本测定(在 EP 管中加入下列试剂)
三、NR 活性计算
注意事项:
1、 当测定的吸光值大于 1.5 或者 ΔA 大于 0.5 时,建议将上清液稀释后测定。
2、 ΔA 测定过小(小于 0.01),可延长酶促反应时间。
3、 建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。
4、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过 0.05。
实验实例:
1、 取 0.1g 小叶黄杨加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后再用提取液稀释 2 倍,之后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定管-A2 测定管=1.4285-1.1089=0.3196,ΔA 空白管=A1 空白管-A2空白管=0.8794-0.8334=0.046,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.3196-0.046=0.2736,按样本质量计算酶活得:
NR(U/g 质量)= 5.359×ΔA÷W×2(稀释倍数)=5.359×0.2736÷0.1×2=29.3244 U/g 质量。
2、 取 0.1g 玉兰加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后再用提取液稀释 2 倍,之后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定管-A2 测定管=1.4696-1.0602=0.4094,ΔA 空白管=A1 空白管-A2 空白管= 0.8794-0.8334=0.046,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.4094-0.046=0.3634,按样本质量计算酶活得:
NR(U/g 质量)= 5.359×ΔA÷W×2(稀释倍数)=5.359×0.3634÷0.1×2=38.9492 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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