供货周期: | 7天 |
品牌: | 博尔森 |
型号: | 100T/96S |
货号: | BES-2265BTK |
羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1. 提取液:自备 6 mol/L 盐酸,提供一个 125mL 空瓶。6 mol/L 盐酸的配制:浓盐酸(37%)和 H2O 的体积比是 1:1。
2. 标准品:0.5 mg/mL 羟脯氨酸标准品。
产品说明:
HYP 是机体胶原蛋白主要成分之一,胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等,因此 HYP 含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
样本经水解产生游离的 HYP,进一步被氯胺 T 氧化,氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应,产生红色化合物,在 560nm 处有特征吸收峰。通过测定样本水解液 560nm 吸光值,可计算 HYP 含量。
技术指标:
最 低检出限:0.057 μg/mL
线性范围:0.117-30 μg/mL
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
天平、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、6mol/L 盐酸和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:称取约 0.2g 样本于玻璃管,将组织尽量剪碎以便消化,盖子稍松不密闭。加入 2mL 的提取液,煮沸或 110℃烘箱 2 至 6 小时消化至没有可见大的团块,冷却后用 10mol/L NaOH(约 1mL)调节 pH 值至 6-8 范围内(不可过酸或过碱),再蒸馏水定容至 4mL。最后 16000rpm,25℃,离心 20min(若离心后仍有杂质,可通过过滤去除),取上清待测。(过程中可能有黑色物质生成,若长时间不能消化,可能为碳化的物质,不影响实验)
2. 细胞:取 500 万个细胞,加入 1mL 的提取液,煮沸或 110℃烘箱 2 至 6 小时消化至透明状,冷却后用 10mol/LNaOH(约 0.5mL)调节 pH 值至 6-8 范围内(不可过酸或过碱),蒸馏水定容至 2mL,16000rpm,25℃,离心 20min,取上清待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 560nm,蒸馏水调零。
2、 将标准品用蒸馏水稀释为 30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234 μg/mL 的标准溶液。
3、 按下表进行操作:
三、羟脯氨酸含量计算公式
注意事项:
1、 如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
2、 试剂有一定的毒性,请操作时做好防护措施,防止吸入或与皮肤接触。
3、按样本蛋白浓度计算时,需单独提取样本中的蛋白质并测定。
实验实例:
1、 取 0.2g 小鼠腿进行样本处理,取上清后按测定步骤操作,使用 96 孔板测得计算 ΔA=A 测定管-A 空白管=0.177-0.06=0.117,带入标准曲线 y=0.0383x+0.022,计算 x=2.48,按样本质量计算含量得:
组织羟脯氨酸含量(μg/g 质量)=4x÷W=4×2.48÷0.2=49.6 μg/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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