单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)活性检测试剂盒 微量法

单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性检测试剂盒说明书

 微量法

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、试剂二：临用前加入 2 mL 蒸馏水充分溶解，4℃保存；

2、试剂三：临用前加入 3.33 mL 蒸馏水充分溶解待用，可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融；

3、试剂四：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加 2 mL 试剂一充分溶解，可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。

产品说明：

MDHAR催化MDHA还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

MDHAR催化NADH还原MDHA生成AsA和NAD+，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD+没有。通过测定340nm光吸收下降速率，来计算出MDHAR活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

研钵/匀浆器、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪和双蒸水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）1：5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2、细菌、细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500-1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL提取液），冰浴超声破碎细胞（功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min）；然后 10000rpm，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。

2、 试剂一在25℃水浴锅中预热30min。

3、 依次在微量石英比色皿/96孔UV板中加入下列试剂

三、MDHAR 活性计算

实验实例：

1、 取 0.1g 橙子果肉加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上，按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=0.8701-0.8396=0.0305，ΔA 空白管=A1 空白-A2空白=0.5515-0.5474=0.0041，按样本质量计算酶活得：

MDHAR (U/g 质量) =0.268×(ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷W=0.268×（0.0305-0.0041）÷0.1=0.070752 U/g 质量。

注意事项：

1. 当 ΔA 测定大于 0.3 时（96 孔板 ΔA 测定大于 0.2），建议客户稀释样本或者调整试剂一和上清液的比例（如将 400μL 试剂一+300μL 上清液改为 600μL 试剂一+100μL 上清液）后进行测定。

2. 当 ΔA 测定过小时，建议客户提高样本量或者调整试剂一和上清液的比例（如将 400μL 试剂一+300μL 上清液改为 200μL 试剂一+500μL 上清液）。

3. 当 A1 大于 1.5 时（酶标仪测定时 A1 大于 2 时），建议将样本稀释进行测定。

4. 空白管为检测各管试剂组份的检测孔，正常情况下，其 OD 值在 0.5 左右（96 孔板在 0.3 左右），变化不超过 0.01。

5. 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！