供货周期: | 7天 |
品牌: | 博尔森 |
型号: | 100T/96S |
货号: | BES-2339BTK |
L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(Gal LDH)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1.试剂一:临用前加入 16 mL 蒸馏水,充分溶解;
2.试剂二:临用前加入 2 mL 蒸馏水,充分溶解。
产品说明:
L-半乳糖途径是合成AsA的主要途径。Gal LDH位于线粒体内膜,负责催化植物体内AsA生物合成的最后一步,也是该途径的关键酶之一,对植物体内AsA含量的积累起着至关重要的作用。
Gal LDH催化L-半乳糖内酯还原氧化型细胞色素C(Cyt c),还原型Cyt c在550nm有吸收峰;测定还原型Cyt c增加速率,来计算Gal LDH活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液器、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
称取约 0.1g 样本,加提取液 1mL,冰上充分研磨,13000g 4℃离心 10min,取上清液置冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到550nm,蒸馏水调零。
2、 按样本数取出一定量的试剂一在25℃水浴锅中预热30 min以上,其余的分装保存(-20℃)。
3、 空白管:依次在微量比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水、160μL预热的试剂一和20μL试剂二,迅速混匀后于550nm比色,记录10s和130s的吸光值,分别为A1,A2,ΔA空白管=A2-A1。
4、 测定管:依次在微量比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL预热的试剂一和20μL试剂二,迅速混匀后于550nm比色,记录10s和130s的吸光值,分别为A3,A4,ΔA测定管=A4-A3。
三、Gal LDH 活性计算
a.使用微量比色皿测定的计算公式如下
(1)按蛋白浓度计算:
Gal LDH活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。
Gal LDH(U/mg prot)=[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T
=0.289×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷Cpr
(2)按样本质量计算
Gal LDH活性单位定义:25℃中每克样本每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。
Gal LDH(U/g 质量)=[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.289×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷W
ε:还原型Cyt c摩尔消光系数,17.3×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,0.2mL=0.0002L;106:单位换算系数,1mol=1×106μmol;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V样总:提取液体积,1mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定;W:样本质量,g;T:反应时间,2min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
(1)按蛋白浓度计算
Gal LDH活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。
Gal LDH (U/mg prot) = [(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T
=0.482×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷Cpr
(2)按样本质量计算
Gal LDH活性单位定义:25℃中每克样本每分钟还原1μmol Cyt c为1个酶活单位。
Gal LDH (U/g 质量) = [(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.482×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷W
ε:还原型Cytc摩尔消光系数,17.3×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.6cm;V反总:反应体系总体积,0.2mL=0.0002L;106:单位换算系数,1mol=1×106μmol;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V样总:提取液体积,1mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定;W:样本质量,g;T:反应时间,2min。
注意事项:
1、在测定酶活时要注意温度。建议取小烧杯一只装入一定量的 25℃蒸馏水,将此烧杯放入 25℃水浴锅中,在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中;若使用 96 孔板,反应期间应放入 25℃培养箱中。
2、建议两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
3、加入最后一种试剂后需迅速混匀并测定 OD 值。
实验实例:
1、 取 0.1g 土豆加入 1mL 提取液冰上充分研磨,13000g 4℃离心 10min,取上清液置冰上,按照测定步骤操作,用微量比色皿测得计算 ΔA 测定管=A4-A3=0.9253-0.7844=0.1409,ΔA 空白管=A2-A1=0,按样本质量计算酶活得:Gal LDH(U/g 质量)=0.289×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ÷W=0.4072 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
GelstainRedTM 核酸染料, 10,000× in water
Super GelBlueTM 核酸染料, 10,000× in water
彩色预染蛋白Marker(10-250kDa, 双色)
琼脂糖 A2015
Super ECL Plus(超敏化学发光检测试剂盒)
PAGE 彩色快速凝胶制备试剂盒(10%)
Minerva Super Fusion Cloning Kit(无缝克隆试剂盒)
Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖检测试剂盒
彩色预染蛋白Marker(10-180 kDa,三色)
FITC-Annexin V/PI 细胞凋亡试剂盒
二安替比林甲烷
焦硫酸钾
偶氮甲碱H
硫酸钾
阿拉伯胶
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