供货周期: | 7天 |
品牌: | 博尔森 |
型号: | 50T/24S |
货号: | BES-2536BTK |
淀粉脱分支酶活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前取 1 瓶加入 3 mL 试剂一,充分溶解后待用,用不完的试剂 2-8℃保存 4 周;
2、 标准品:10 mg 无水葡萄糖。临用前加入 1 mL 蒸馏水溶解,配成 10 mg/mL 葡萄糖溶液备用,2-8℃可保存两周。
淀粉脱分支酶(starch debranching enzyme,DBE)能够专一、高效的裂解支链淀粉的α-1,6-糖苷键,对淀粉的结构起“修饰”的作用,淀粉脱分支酶在调整支链淀粉侧链的链长方面起着关键作用,淀粉分支酶和淀粉脱分支酶的平衡使得支链淀粉合成。
DBE催化支链淀粉产生还原糖,其与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕红色物质,通过测定其在540nm下吸光值变化可计算得DBE活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅或恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 15000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
2、细胞或细菌:按照细胞或细菌数量(104个)︰提取液体积(mL)为 500~1000︰1 的比例(建议 500 万个细胞或细菌加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 15000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。(若溶液有浑浊则离心后取上清测定)
3、液体:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。
2、 将 10mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为 0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg/mL 的标准溶液备用。
3、 取 250μL 样本沸水浴 5min(盖紧,防止水分散失),冷却至室温后,8000g,常温离心 5min,取上清备用。
4、 操作表 (在 1.5mL 离心管中) :
三、DBE活性计算
1、 标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度为 x 轴,其对应的 ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y=kx+b,将 ΔA 带
入方程得到 x(mg/mL)。
2、 DBE 活性的计算:
(1)按蛋白浓度计算
酶活定义:每 mg 蛋白每小时分解支链淀粉产生 1mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。
DBE 酶活(U/mg prot)=x×V 提取÷(V 提取×Cpr)÷T=0.5x÷Cpr
(2)按样本质量计算
酶活定义:每 g 样本每小时分解支链淀粉产生 1mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。
DBE 酶活(U/g 质量)=x×V 提取÷W÷T=0.5x÷W
(3)按细胞或细菌数量计算
酶活定义:每 104 个细胞每小时分解支链淀粉产生 1mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。
DBE 酶活(U/104 cell)=x×V 提取÷细胞数量(万个)÷T=0.5x÷细胞数量(万个)
(4)按液体体积计算
酶活定义:每 mL 样本每小时分解支链淀粉产生 1mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。
DBE 酶活(U/mL)=x×V 样÷V 样÷T =0.5x
V 提取:提取液体积,1mL;V 样:加入的样本体积,0.2mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间:2h。
1、 A大于1时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。
2、 建议每次实验沸水浴后冷却时间保持一致。
1. 取 0.1g 大米,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆,然后 15000g,4℃,离心 10 min,取上清置于冰上待测,取上清后再用提取液稀释 10 倍,之后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA=A 测定管-A 对照管=0.390-0.125=0.265,标准曲线 y=2.248x-0.1896,计算 x=0.202,按样本质量计算酶活得:
DBE 酶活(U/g 质量)=0.5x÷W×10(稀释倍数)=10.1 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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