猪生殖与呼吸综合症病毒美洲型经典株探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

猪生殖与呼吸综合症病毒美洲型经典株探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

【产品名称】

中文名称：猪生殖与呼吸综合症病毒美洲型经典株探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：Classical Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus(C-PRRSV) RT-PCR Kit

【包装规格】

50T/盒

【检验原理】

本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，设计一对猪生殖与呼吸综合症病毒美洲型经典株(C-PRRSV)特异性引物，结合一条特异性探针，用一步法荧光RT-PCR技术对猪生殖与呼吸综合症病毒美洲型经典株(C-PRRSV)的核酸进行体外扩增检测。

【包装规格及成分】

【储存条件及有效期】：

1.试剂盒应置于-15℃以下冷冻避光储存；有效期12个月，采用泡沫盒加生物冰袋密封运输，温度不超过8℃，生产日期及有效期详见外包装盒。

2.试剂盒避免反复冻融，冻融次数不超过5次，开封后-15℃以下冷冻避光储存，不影响有效期内使用。

【适用仪器】：

ABI、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。

【标本采集】：

1.根据实际情况可采取病毒/组织/血液等样品1g作为检测样本

2.应避免样本间交叉污染，样本采集后应及时检测，也可保存于-20±5℃待检，长期保存应置于-70℃以下。

【样本保存及运输】：

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】：

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

1)组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；

2)全血样本：待血凝固后，取血清100μL于1.5mL灭菌离心管中。

1.2核酸（RNA）提取

根据您实验室的具体情况和样品类型，选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠，我们建议使用商品化病毒DNA/RNA提取试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明书进行操作，样本核酸提取过程中应避免污染，提取好的模板样品如不能立即检测，建议-15℃以下保存。

推荐采用我们公司研发生产的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒

2.试剂配制（试剂准备区）

2.1从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温（20～25℃），注意避免强光照射，待完全溶解后振荡混匀并低速离心10 s，使用低吸附吸头分液取样，避免试剂损失和浪费。

2.2根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

2.3在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后2000 rpm离心10 s，按照20μL/管分装量将试剂分装至八联PCR反应管中。

2.4盖紧八联PCR反应管盖,并注意做好相应标识（请标记在八联PCR反应管盖两端突出部位，切勿标记在八联PCR反应管盖中间，以免影响信号采集）。将PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。

3.加样（样本处理区）

将步骤1.2提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心，核酸加样过程中应避免污染。

4.PCR扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内,并记录放置顺序；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；

4.3荧光通道选择：检测通道选择FAM，淬灭通道选择NONE，参比荧光选NONE。

【推荐循环参数设置】：

5.【结果分析判断】

5.1结果分析条件设定

设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

1）阳性：检测通道Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

2）可疑：检测通道Ct值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现Ct值≤38.0和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

3）阴性：检测结果Ct值无Ct值，无明显的扩增曲线。

6.【质控标准】

1）阴性质控品：无明显扩增曲线或无Ct值显示；

2）阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤30；

3）以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.【产品性能指标】

1）阴阳性参考品符合率：5份阳性参考品符合率为100％；10份阴性参考品符合率为100％。

2）最低检测限：1.0×103copies/mL。

3）精密度：批内、批间精密度检测Ct值的变异系数（CV）均小于等于3%。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！