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研究背景
端粒是位于染色体末端的保护性结构，是在哺乳动物中由(TTAGGG)n和相关蛋白的混合物组成的串联重复DNA序列。端粒在许多细胞过程中起着保护染色体免受降解、激活复制衰老和调节基因表达等重要作用。
在体细胞中，端粒脱保护触发DNA损伤反应和端粒介导的复制性衰老，可以被视为阻止正常老化细胞增殖的内在过程。端粒也会导致干细胞的耗竭和健康细胞更新的丧失、组织再生缺陷、组织功能下降、衰老细胞积累等。而衰老细胞在组织中的积聚被认为是长期慢性炎症和与年龄相关的疾病（包括癌症）的主要原因。生物年龄是许多慢性疾病发病率的主要预测因素。在正常细胞衰老过程中，端粒完整性的丧失也会引发DNA损伤信号，最终导致衰老表型。
荧光显微镜有助于研究人员研究端粒的动力学、形状、定位和蛋白质的共分布。研究这些结构的显微镜工具目前已发展到能够对影响端粒的分子机制进行探究。作者以人类成纤维细胞为例，利用多种显微镜，以及两种超分辨率技术，即三维结构照明显微镜(3D-SIM)和直接随机光学重建显微镜（dSTORM）来研究端粒的几个特征。在本文中，重点介绍直接随机光学重建显微镜（dSTORM）对于端粒研究的益处。
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研究介绍（节选）
一、端粒可视化
深入了解维持端粒完整性所涉及的途径和蛋白质，对于提高细胞寿命和延缓年龄相关疾病发病至关重要。大约25年前，端粒DNA首次被荧光显微镜观察到，只是那时候显微技术的分辨率还有待提高。大约150年前，恩斯特·阿贝首先描述了分辨率极限，它被定义为两个物体之间的最短距离（在这个距离上，它们可以被区分为两个独立的实体）。对于远场荧光显微镜，光学分辨率由光波长和物镜的数值孔径决定。
此外，细胞特征和背景之间的反差会降低图像的分辨率，要求研究人员使用明亮的探针。虽然在荧光显微镜中，样品中的对比度通常不是唯一因素，但分辨率在物理上受到光的衍射的限制，其横向(X，Y)分辨率为200-250纳米，轴向(Z)分辨率为500-700纳米。为了突破衍射极限，需要在横向、轴向或两者同时提高两倍或更多的分辨率，目前已经开发了各种技术。
可视化、分析和定量单个端粒的首选技术之一是将端粒上发现的TTAGGG序列与荧光标记肽核酸(PNA)探针直接杂交。这种被称为荧光原位杂交(FISH)的技术，可以用来测定中期扩散的端粒长度，因为更多的串联端粒序列（即更长的端粒）允许更多的PNA分子结合，因此可以看到更亮的“斑点”。为了说明FISH的应用，作者对衰老前成纤维细胞进行中期扩散，并用Alexa Fluor488结合PNA探针染色端粒DNA。
图1、衰老成纤维细胞端粒荧光原位杂交、BJ成纤维细胞染色体畸变的图像。
（A）一个有46条染色体的衰老前期BJ细胞的中期扩散，DNA用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚/DAPI（蓝色）和端粒用PNA Telc-488探针（绿色）染色。
（D）姐妹染色单体上的无信号端
（E）间质端粒序列和姐妹端粒丢失导致一个无信号端。
作者观察了预期的46条染色体，大多数染色体末端含有可检测到的端粒染色。将FISH应用于中期扩散对于确定染色体畸变（包括含有无信号末端的染色体）是很重要的。在这种情况下，端粒太短则不能被PNA探针识别，荧光信号太暗则不能在图像采集期间被检测器读取。对无信号末端的存在，可以进行估计，可估计有多少极短的染色体或可能没有端粒DNA。
SIM和STED可以通过控制照明光来提高分辨率，SMLM技术只记录每张图像中荧光团总数的稀疏子集，以实现20-50纳米的成像分辨率。即使成像分子表现为衍射限制点，只要它们彼此相距至少200纳米就可以通过拟合和质心查找来确定它们的准确定位。超分辨率显微镜和优化的成像技术显著提高了对端粒生物学的理解。由于端粒在间期细胞内的半径低于衍射限制分辨率，通常为60-100纳米，因此利用超分辨率技术来研究端粒的大小和形状越来越受到人们的关注。
二、构建端粒形状
直接随机光学重建显微镜（dSTORM）通过荧光染料的“闪烁”操作，利用单个荧光团的时间分离来工作，即在任何一个时间只记录来自稀疏的单个荧光团集的发射，再经过拟合和质心查找，将获取的图像序列转换为高分辨率图像。通常是使用Alexa Fluor647（Thermo Fisher Scientificial），意味着单个Alexa Fluor647分子经历了开-关（亮-暗）循环，在每次采集视场中只有约1%的荧光团发射光，利用Alexa Fluor647共轭PNA探针染色，将样品浸入氧清除缓冲液中以促进光开关并多次循环重复，获取时间序列后，利用高斯拟合可以重建超分辨率图像，以此来实现20-30纳米的横向分辨率。
超分辨率技术dSTORM最初被用于可视化来自不同类型细胞的端粒的非环结构。早期的电子显微镜显示，端粒DNA的物理末端会折叠并置换一条DNA链，形成所谓的T环结构。另外的研究表明，这种重要的结构在特定的防护蛋白缺失时会丢失，导致DNA损伤反应的激活。这些研究表明，dSTORM是一种非常强大的技术，可以准确地显示T环的结构。
作者计算、重构和可视化了dSTORM的数据，在分析点云的单个大小和形状时，发现端粒是极其不均匀的，并不总是以球形结构出现。例如，它们可能在一个维度上被拉长，形成一个更椭圆形或矩形的形状，或者非常不规则。当对BJ细胞中的单个点云进行三维可视化时，作者还观察到了各种不同的形状。当观察到球形端粒，作者经常发现不规则的异构结构，这为端粒区域的性质提供线索。这些图像显示了BJ成纤维细胞端粒DNA的不同三维排列，证实了3D-STORM是研究端粒形状的合适技术。
图2、3D-STORM测定端粒形状的变异性。
（A)一个二维宽视场快照的例子，一个表示3D的像散宽视场快照，重构3D- STORM数据的最大强度投影，以及PNA TelC-647探针染色的BJ成纤维细胞的覆盖图像。比例尺=5 μm。
（B) NEO SAFe软件中单个本地化的可视化。每个点代表一个分子，使用DBSCAN将它们分组成簇。不同的颜色代表z位置。
比例尺= 4 μm，其中红色= x轴，绿色= y轴，蓝色= z轴。识别出各种不同的形状，包括球形(C)、不规则(D)和桥状结构(E)。标尺杆= 50 nm，其中红色= x轴，绿色= y轴，蓝色= z轴。
三、测量端粒大小
由于3D-STORM的横向分辨率为20-30纳米，轴向分辨率为50-70纳米，因此可以用来测量端粒大小。根据SMLM成像，端粒大小的一个常见读数是回转半径，即每个单个分子到分子云质心位置（质心）的均方根距离。然而，由分子云的最外层点确定的端粒体积也可以作为尺寸的读出值。利用这些测量，研究小组试图计算端粒密度或压实，它代表一定体积内端粒DNA的数量，以探索端粒DNA是如何包装的。然而，Alexa Fluor647的光开关特性使得在dSTORM采集过程中，一个Alexa Fluor647分子可以被多次检测。因此，虽然短端粒平均来说比长端粒有更少的开关周期，长端粒含有更多的PNA探针，但一个定位并不等于一个Alexa Fluor647分子。这使得很难根据定位的数量和大小来提取密度测量值。一种可能是根据每个端粒焦点的定位数量来绘制体积，放松会导致更垂直的绘制线路。然而，如果PNA探针杂交受到端粒致密状态的影响，其密度可能被低估。另一个需要注意的特点是3D-STORM有一个有限的Z深度，通常在800-1000纳米左右。因此，为了覆盖整个核，需要在多个焦平面上进行三维STORM成像，并进行折射率校正。尽管劳动强度很大，这项技术揭示了线粒体和微管之间的新的相互作用，并可能对端粒与核膜的相互作用提供更多的见解。它对于T环的可视化和单个短端粒的尺寸测量非常强大，超出了3D-SIM所能实现的范围。
图3、通过不同的方法，将端粒的大小与宽视场、3D-SIM和dSTORM显微镜技术所能分辨的最小体积进行比较。
传统的显微镜技术使了解端粒生物学基础成为可能，但端粒的纳米级研究还确实需要随机光学重建显微镜STORM等超分辨率显微镜。目前，在国内，随机光学重建显微镜STORM已成功实现商用，有需要STORM成像技术进行实验研究的专家老师们，请文末填写问卷，即可预约获得 iSTORM 超高分辨率显微成像系统试拍服务~
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参考文献
Adam N, Beattie TL, Riabowol K. Fluorescence microscopy methods for examining telomeres during cell aging. Ageing Res Rev. 2021 Jul;68:101320. doi: 10.1016/j.arr.2021.101320. Epub 2021 Mar 17. PMID: 33744488.
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