文献解读 知识分享

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研究介绍（节选）

肾脏疾病的诊断非常复杂且具有挑战性，通常需要使用到光学显微镜（LM）、免疫组织学和电子显微镜（EM）。EM在~50%的天然肾活检的组织病理学中比较有用，对~20%的诊断也是十分重要，这使得EM在许多国家/地区成为天然肾活检检查的标准技术。EM常用于诊断与基底膜结构异常、原纤维疾病和罕见的遗传性疾病相关的肾脏疾病。它也经常用于记录足细胞的形态变化，并记录免疫复合物或补体片段沉积物的形状、亚结构和相对于肾小球基底膜 （GBM）的位置。

然而，目前世界上大部分人都无法使用上EM仪器，且在可使用的地方，相关的专家和设施的数量也正在减少。对于发展中国家和发达国家来说，找到一种更便宜的EM替代品，来增强诊断能力，超越LM和IF，减少所需的仪器数量、简化和加速诊断工作流程，是非常重要的。

近年，光学显微镜已经通过超分辨显微镜（SRM）技术突破了衍射极限，如结构化照明显微镜（SIM）、随机切换单分子定位显微镜（SMLM）技术、光激活定位显微镜和随机光学重建显微镜（STORM）等。

如直接随机光学重建显微镜（dSTORM）的技术所示.在之前一种作者称之为“easySTORM”的方法中，作者已经证明了dSTORM可以使用多模二极管激光器和多模光纤以相对较低的成本（<20,000 英镑）在大视场上（>120 × 120 μm）稳定提供超分辨图像。作者表明，这种方法可以应用于临床组织学切片，以使用临床批准的抗体提供超分辨率的IF成像。作者将其描述为“histoSTORM”方法。

作者特别探讨了在肾脏疾病诊断中，用histoSTORM取代EM的可能性，或许能提供一种仪器成本较低的、能够广泛使用的临床工具。这是在早期使用SIM 和STORM 研究GBM中的肾足细胞亚结构和蛋白质组织的工作之后进行的。虽然之前的工作证明了超分辨IF的潜力，但它是通过昂贵的商业SRM仪器实现的，并且利用STORM的研究是用小鼠组织和非临床批准的抗体进行的。

作者的目标是开发一种低成本的方法，让大部分国家地区的临床医生可以使用“easySTORM”对临床相关蛋白质进行成像，并且能使用现有的临床验证抗体制定实用方案来处理现有的活检样本，如冷冻切片或石蜡（FFPE）切片等。作者注意到STORM以前已被应用于病理学研究，例如研究表观遗传调节和癌症的进展等。

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研究结果

在最初的小型研究中，作者将带有标准临床批准抗体的 histoSTORM 应用于 FFPE 和冷冻组织切片。作者相信下面呈现的示例性结果显示了可能有助于诊断的、具有临床意义的超微结构。

膜性肾小球肾炎（图1）的特征是基底膜内膜含有IgG的上皮下免疫复合物沉积物，且该结构增厚。图1D中的双色宽视场IF图像显示了一个毛细管环，其中GBM为绿色，带有抗人层粘连蛋白探针（绿色，Alexa Fluor 555），过滤屏障上皮侧的IgG沉积物为红色（IgG，iFluor 647）。以每像素25nm显示的dSTORM图像显示了与EM观察到的图像一致的定义明确的上皮下沉积物（图1F，I）。虽然在宽视场IF图像中没有明确的结构定义（图1D，G），但在dSTORM中很容易观察到上皮下区域的免疫沉积物的细节和免疫沉积物含量的梯度（图1E，H）。dSTORM图像的绿色区域表示无免疫沉积物的GBM区域，黄色区域表示层粘连蛋白和免疫沉积物的重叠，红色区域表示免疫沉积物簇。

图1、膜性肾小球肾炎。基底膜（层粘连蛋白，绿色 - Alexa Fluor 555）和IgG沉积物（红色 - iFluor 647）。

狼疮性肾炎的特征是多克隆 IgG 在肾小球不同区域的肾小球沉积 。图2显示了Iv期狼疮肾炎肾小球毛细血管中IgG（红色，iFluor 647）的沉积和基底膜染色（层粘连蛋白，绿色，Alexa Fluor 555）。在此阶段，系膜（图2G），内皮下（图2H）和上皮下（图2I）IgG沉积物很容易用dSTORM观察到，并概括了用EM记录的高电子密度IgG沉积物的分布（图2C）。

图2、狼疮性肾炎IV型。基底膜（层粘连蛋白，绿色 - Alexa Fluor 555）和IgG沉积物（红色 - iFluor 647）。

easySTORM提供了分辨率低于衍射极限的大视场（120μm×120μm）允许评估肾小球毛细血管中的GBM厚度并记录肾小球的其他方面。图3A、C显示了来自微小变化疾病活检的FFPE切片的宽视场落射荧光图像，其中GBM中的层粘连蛋白用iFluor 647标记。图3B、D显示了相应的STORM图像，并确认了STORM图像在衍射极限以下进行GBM厚度测量的能力。图3F、G显示了通过GBM的宽视场和STORM图像的线段。图3E显示了GBM宽度为281nm的电子显微镜照片。

图3、微小变化病：GBM厚度测量（层粘连蛋白-iFluor 647）。

参考文献

Garcia E, Lightley J, Kumar S, Kalita R, Gőrlitz F, Alexandrov Y, Cook T, Dunsby C, Neil MA, Roufosse CA, French PM. Application of direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) to the histological analysis of human glomerular disease. J Pathol Clin Res. 2021 Sep;7(5):438-445. doi: 10.1002/cjp2.217. Epub 2021 May 21. PMID: 34018698; PMCID: PMC8363924.