超分辨率荧光显微镜在揭示动物细胞中详细的亚细胞结构方面取得了巨大的成功。然而，由于许多技术挑战，包括植物细胞的一般高荧光背景和细胞壁的存在，其在植物细胞生物学中的应用仍然极其有限。在本文中，作者利用随机光学重建显微术（STORM）对拟南芥幼苗完整根系进行成像，利用超分辨率图像对拟南芥根尖不同部位皮层微管的空间组织进行了定量分析。
一.研究介绍
植物细胞具有高度各向异性的形状，对细胞功能和多细胞发育很重要。皮层微管阵列是决定植物细胞形态发生的关键因素之一。在快速扩张的植物细胞中，皮质微管通常密集排列，彼此平行，横向于生长方向。皮层微管结构和组织的详细定量信息对于理解细胞扩增和定向生长的机制至关重要。因此，在本研究中使用皮质微管阵列作为测试用例，以开发在整个幼苗根尖内进行超分辨率成像的技术。通过将STORM与可变角度落射荧光显微镜相结合，成功地证明了整个植物组织成像中 20-40nm的空间分辨率。如此高的空间分辨率对于解决植物根部活动伸长区致密的皮质微管结构至关重要的。
二.研究结果
皮质微管阵列的图像是根据17-25分钟内捕获的 20,000-30,000帧重建的。由于根样本成像中的背景噪声普遍较高，与之前发表的几种动物细胞 STORM成像相比，当前研究选择了较慢的20Hz帧速率。
拟南芥根尖伸长区完整表皮植物细胞皮质微管网络的 VAEM-STORM 成像
(A)伸长区细胞的明视场图像。这里所示的单元在图4A中也被突出显示为区域d。在亮场图像中，细胞之间的边界用绿色虚线突出显示。(B)伸长细胞中致密皮层微管网络的落射荧光图像和（C）相应的STORM图像。(D)放大的STORM图像，如（C）中的白色区域所示。(E)细胞中微管束的横截面轮廓[（D）中红色框中突出显示]。直方图显示红框指定区域内位置的横截面分布。红线是五个简单高斯函数的拟合结果，显示了相距80.0 nm ~ 137.9 nm的单个微管的中心。比例尺：3 μ m（A-C）和500 nm（D）。
皮质微管阵列通过直接引导细胞壁物质的沉积，在控制植物细胞生长和各向异性方面起着关键作用。这主要是通过确定纤维素合成和沉积过程中纤维素合酶复合物的定向运动和质膜插入位点而发生的，这限制了植物细胞扩张的方向。
手动和使用微丝分析仪（MFA）软件进行分析。(A)整个根尖的明视场图像。图像是具有与落射荧光和STORM成像相同的光学设置（100×物镜）的单个图像的拼贴。因此，在相同放大倍数下，可以从亮场图像中容易地确定用于STORM成像的细胞在整个根部中的位置。（B，C）显示用于STORM成像的细胞位置的放大明视场图像。(D)亮场图像中突出显示的细胞的VAEM图像和（E）STORM图像，对应于（B）中的红框。(F-G)VAEM图像（F）和STORM图像（G）中微管丝方向的极坐标图，分别在（D，E）的红色框中突出显示。单元的长轴在极坐标图中以紫色轴表示。(H-K)使用MFA软件进行定向分析的结果。偏移角为90 °（长轴），在极坐标图中未校正，与（F，G）一致。主要角度在极坐标图中以绿色星形突出显示。请注意，由于两种不同的测量方法，图（F、G）和图（H-K）的形式不同。比例尺：30 μ m（A）和3 μ m（B-I）。
完整拟南芥根部不同部位皮质微管的 VAEM-STORM 成像
(A)根尖明视野图像的拼接。突出显示了穿过根尖的七个区域（a-g），并选择用于dSTORM成像。(B)（A）中白框区域的放大明视场和相应的落射荧光和STORM图像。显示完整拟南芥根尖的帽细胞（a）、分生组织区（b）、伸长区（c-d）、分化区（g）和伸长与分化之间的过渡区（e-f）中的表皮细胞的皮层微管的图像。注意，图1中显示了区域d中细胞的放大明场图像、落射荧光图像和STORM图像。单元格边界以红色虚线突出显示。区域f和g中的细胞显示出不同的微管组织模式，因此它们在图5中被分别分析为f1、f2和g1、g2，如在相应的明场图像中所示。比例尺：50 μ m（A）和3 μ m（B，a-g）。
以上，作者成功地将STORM成像技术应用于拟南芥根细胞皮层微管，分辨率低于50nm。结果表明，不同分化阶段或类型的细胞皮层微管的密度和空间组织存在显著差异。所开发的方法可应用于植物细胞生物学过程，包括细胞骨架、细胞器亚结构和膜结构域的附加元件的成像。我们也期望这些超分辨率成像的进展将使植物细胞中生物过程的详细空间组织取得关键进展。
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参考文献
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