近年来,人类诱导多能干细胞 (iPSCs) 的研究在细胞与基因治疗领域迅速增长,同时,在其生产工艺的诸多环节也存在很多瓶颈。其中,建立 iPSC 单细胞库并确认单克隆源性,且为监管部门提供有力的证据是非常关键且具有挑战性的。为了应对挑战,安达望的 Solentim 系列产品包括 VIPS PRO 单细胞铺板仪、Cell Metric X 单克隆成像仪和 STUDIUS 智能软件平台,提供了高效单细胞铺板的方法,以及基于高清图像的单克隆证据,以确保高效的 iPSC 工艺开发流程以及有力的提交审批的证据。
此外,使用 MatriClone(一种可溶性基质胶)结合 VIPS PRO 进行铺板,有效提高单克隆铺板及恢复率,助力 iPSC 的高效工作流程。
方法及材料
细胞培养
人类诱导多能干细胞株 (STBCi044-B) 在 Corning® TC 处理的 6 孔板中培养,使用 MatriClone,在 mTeSR™ Plus 培养基中,使用 0.25µg/cm2 的浓度进行培养。
单细胞铺板
将 MatriClone (0.25 µg/cm2) 、10% CloneR 加入 mTeSR Plus 培养基中,制备浓度为 9,750个/ml 的单细胞悬液,使用 VIPS PRO 进行单细胞铺板,将细胞铺入到 5x96 孔板(Corning® TC - 处理)中。
成像及染色
将细胞从 DAY0 至 DAY10 进行全孔成像,追踪克隆生长。并对 VIPS PRO 铺板的克隆进行多能性评估,使用 SSEA4、OCT4 和 DAPI (Invitrogen™,A24881) 进行免疫组学染色。
图 1:使用 VIPS PRO 及 MatriClone 进行单细胞铺板流程图
VIPS PRO 联合 MatriClone 提高 iPSC 的细胞铺板率及恢复率。
VIPS PRO 联合 MatriClone 使用,相对于有限稀释 (LD) ,能够显著提高单细胞铺板率(图 2)以及单克隆恢复率(图 3)。
图 2:单细胞铺板率。LD(灰色),VIPS PRO(蓝色)数据平均值±SEM (n=5)
图 3:单克隆生长率。LD(灰色),VIPS PRO(蓝色)数据平均值±SEM (n=5)
iPSC 在铺板及生长阶段维持稳定性以及干性。
使用 MatriClone 作为基质胶培养的 iPSC 克隆团形态完整,具有明显边界,细胞紧密排列,核质比高(图 4)。
图 4:铺板后 DAY10 iPSC 整孔图像;a) 整孔图像;b) iPSC 克隆团放大图像
图 5:VIPS PRO 铺板后进行 SSEA4 和 OCT4 免疫组化染色
我们对铺板后的克隆团进行干性基因 SSEA4 和 OCT4 的检测,结果显示,使用 VIPS PRO 进行铺板不会影响多能性。
结 论
VIPS PRO、MatriClone 和 STUDIUS 的组合为 iPSC 工作流程提供了一种有力的解决方案:
STUDIUS 提供的自动化数据分析和跟踪功能可实现数据完整和方便溯源。
温和且高效的铺板方法以及可溶性基质胶的使用可实现高克隆生长率。
一次性耗材以及 STUDIUS 软件的 21 CFR Part 11 合规功能确保符合 GMP 生产。
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